源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮 莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 草甘膦是一種廣譜滅生性、內吸傳導型優(yōu)秀除草劑，廣泛用于果園、膠園、非耕地、 免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理。1974年在美國注冊登 記以來，至今已在世界100多個國家注冊，成為世界上使用面積最大的除草劑品種之一。但 是該除草劑同樣是一種非選擇性除草劑，對農(nóng)作物同樣有著殺死作用。為了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中 使用草甘膦，必須培育出具有草甘膦抗性或者降解性的農(nóng)作物。
[0003]草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate)毒性作用機理是競爭性抑制 莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性。該合成酶是植物和微生物體 內芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）生物合成過程中的一個關鍵酶，該酶由 基因編碼。
[0004]目前種植抗除草劑轉基因作物的國家越來越多，面積也迅速增加，種植面積不斷 擴大，占全球種植轉基因作物的78%以上。根據(jù)2002年資料表明，耐草甘膦大豆依舊是美 國、阿根廷、加拿大、墨西哥、羅馬尼亞、烏拉圭和南非等七國的主要商品化轉基因農(nóng)作物。 耐草甘膦除草劑大豆在全球范圍內種植3650萬公頃，占全球總轉基因農(nóng)作物種植面積的 62%。然而現(xiàn)在應用于生產(chǎn)的抗草甘膦基因僅有兩個，且都受到專利的保護，因此發(fā)掘新型 的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因對于培育具有自主知識產(chǎn)權的抗草甘膦轉基因 作物將是非常有必要的。
[0005] 最近，來自于極端微生物體內的好多酶都已成為研究的熱點，主要是因為微生物 生長在極端環(huán)境中從而使這些酶可能具有潛在的特殊的生物功能。極端嗜熱菌海棲熱袍 菌胤r(ia?a)是一種革蘭氏陰性菌，該菌最適生長溫度80°C，在pH=5. 5-9. 0和 NaCl濃度0. 25%-3. 75%之間生長，嚴格厭氧。在過去的幾年時間里，很多來自該極端嗜熱菌 的酶被分離出來并進行研究了。然而來自該菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶還從 未研究過，也未見對該酶功能的研究報告。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草 酸-3-磷酸合成酶基因及其應用，利用基因合成法制備海棲熱袍菌基因，并對該基 因進行酶動力學特性分析和功能試驗驗證，以證明其具有較高的草甘膦耐受性。
[0007] 本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的： 一種源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其核苷酸序 列如SEQIDNo1，其編碼的蛋白質序列如SEQIDNO2。
[0008] 所述來源于海棲熱袍菌的基因，含1266個堿基，編碼的氨基酸421個。
[0009] 所述來源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因應用于草甘膦 耐受性中。
[0010] 所述的來源于海棲熱袍菌的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，它 是根據(jù)植物密碼偏愛通過化學合成方法得到的。即采用大量重疊的引物通過兩步PCR進行 全基因的合成（PTDS)(NucleicAcidsResearch，2004,32:e98)。
[0011] 具體合成方法包括以下步驟： 引物設計：設計長度大概為60bp左右的覆蓋整個5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶 基因的寡核苷酸的序列33個，其中每相鄰的兩個寡核苷酸序列有20個堿基的重復。
[0012] PCR擴增：利用PCR進行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶擴增。其中，在100W 反應體系中，P2~P32共31個引物的添加量為2ng，兩個外側引物Pl和P33的添加量為30ng， 擴增條件為：94°C預熱lmin，94°C30s，50°C30s，72°ClOmin，使用的TaqDNA聚合酶為KOD FXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25個循環(huán)。
[0013] 轉化：PCR結束后，用1%瓊脂糖膠回收片段，取IOW直接與T/A克隆載體相連(大 連寶生物公司）。4°C連接過夜，在DH5a感受態(tài)中高效轉化，獲得長度為1266bp的SEQID No1序列的陽性克隆，即為本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，經(jīng)序列測定， 其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。
[0014] 將上述獲得的陽性克隆利用BamHI和SacI進行雙酶切后，通過T4DNA連接酶將 該基因與原核表達載體PYM4087(CurrMicrobiol，2011，62 :833-839)相連，4°C連接2小 時。然后將該載體轉化感受態(tài)大腸桿菌TOP10(Invitrogen)。將菌液涂布于含有50iig/mL 氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基（15g/L瓊脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl， 磷酸緩沖液pH=7. 0) 37°C過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落，接種于50ml液體LB培養(yǎng)基（IOg/ L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，磷酸緩沖液pH=7. 0)中，37°C搖床直到菌液的 濃度達到〇D_為1. 0時停止培養(yǎng)。培養(yǎng)液在5,OOOg重力加速度下離心5min，無菌水清洗 1次。所得的細胞沉淀用ImL磷酸裂解緩沖液重懸，然后將其轉移到微量離心管中。使用 超聲波儀裂解菌液30min，以12,OOOg離心30min。用凝膠-蛋白純化試劑盒HisTrapHP (AmershamBiosciences公司）對其進行蛋白表達純化。然后對其進行酶動力學特性分析。
[0015] 本發(fā)明的來源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶不僅具有較高 的草甘膦抗性，而且還與PEP保持較強的親和性，這些特征將為用于轉基因作物的培育提 供可能。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明的來源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的 SDS-PAGE電泳圖，其中1為蛋白分子量MARKER，2代表在大腸桿菌BL21 (DE3)過量表達的 5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白，3為用HisTrap HP試劑盒純化的5-烯醇丙酮莽 草酸-3-磷酸合成酶蛋白。
[0017] 圖2為本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的草甘膦耐受性實驗結果，其 中： a代表在草甘膦濃度為OmM時大腸桿菌coJi)ER2799(攜帶p251-AroA- T1. 質粒）、ER2799 (攜帶p251-AroA-Z?.coJi質粒）和大腸桿菌ER2799 生長情況； b代表在草甘膦濃度為150mM時大腸桿菌ER2799 (攜帶p251-AroA- 7： 質 粒）、ER2799 (攜帶p251-AroA-i5：coii質粒）和大腸桿菌ER2799生長情況； c代表在草甘膦濃度為300mM時大腸桿菌ER2799 (攜帶p251-AroA- 7： 質 粒）、ER2799 (攜帶p251-AroA-i5：coii質粒）和大腸桿菌ER2799生長情況； d代表在草甘膦濃度為400mM時大腸桿菌ER2799(攜帶p251-AroA- 7： 質 粒）、ER2799 (攜帶p251-AroA-i5：coii質粒）和大腸桿菌ER2799生長情況； e代表在草甘膦濃度為450mM時大腸桿菌ER2799(攜帶p251-AroA- 7： 質 粒）、ER2799 (攜帶p251-AroA-i5：coii質粒）和大腸桿菌ER2799生長情況。
【具體實施方式】
[0018] 以下結合【具體實施方式】詳細描述本發(fā)明的技術方案。實施例僅用以說明本發(fā)明的 技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人 員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的 精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。
[0019] 本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇（Sigma-Aldrich)公司。
[0020] 本發(fā)明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書【J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學出版社】。
[0021] 實施例1基因合成法合成來源于海棲熱袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成 酶基因 根據(jù)來源于海棲熱袍菌的序列（NCBIReferenceSequence:NC_000853.1)采取 連續(xù)延伸PCR(NucleicAcidsResearch, 2004，32，e98)按照植物密碼子偏愛合成的 5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，設計33對引物用于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸 合成酶基因的人工合成。所設計的引物如下：


利用PCR進行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因擴增，在IOOW反應體系中，P2 至P32共31個內側引物的添加量為2ng，外側引物P1~P33添加量為30ng，擴增條件為：94°C 預熱11^11;941