攜帶mage-a3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體及構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中的載體及其應(yīng)用，特別是涉及攜帶黑色素瘤相關(guān)抗 原-A3 (Melanoma-associated Antigen_A3 ;MAGE_A3)抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體及 其構(gòu)建方法與其在制備抗MAGE-A3陽性的腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus ;AAV)的基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)被鑒定。1983 年，Samulski等人描述了AAV的末端重復(fù)片段（上游5'端片段，下游3'端片段） (Samulski RJ, Srivastava A, Berns KI, Muzyczka N. Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids: gene correction within the terminal repeats of AAV. Cell. 33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染顆粒的 復(fù)制蛋白（rep)基因和包膜蛋白（cap)基因（l.Hermonat PL, Labow MA, Wright R, Berns KI,Muzyczka N. Genetics of adeno-associated virus: isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.J Virol.51:329-339. 2. Hermonat, P. L. , and Muzyczka, N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6466-6470.)〇1986 年，Labow等人鑒定了位于上游5'端片段和rep基因之間的p5啟動(dòng)子（Labow MA, Hermonat PL, Berns KI.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome. J Virol. 160:251-258.)〇
[0003] 1984年，美國PaulL.Hermonat證明AAV載體可用于人類疾病的基因治療 (Hermonat,P.L. ,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalian DNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissue culturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81:6466-6470.)。目前，主要是歐美國家在進(jìn) 行以AAV為基礎(chǔ)的基因治療人類疾病的臨床試驗(yàn)。據(jù)美國糧食和藥品管理局統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有十 余項(xiàng)以AAV為基礎(chǔ)的基因治療臨床試驗(yàn)正在進(jìn)彳丁，主要是將攜帶治療基因的AAV病毒注入 患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)治療基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。主要針對(duì)治療的疾病有帕 金森氏綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血友病、心力衰竭、進(jìn)行性肌萎縮和奧茲海默綜合癥等非腫 瘤性疾病。2012年11月2日歐盟批準(zhǔn)UniQure公司的Glybera產(chǎn)品在歐盟27個(gè)成員國使 用，這是西方國家第一個(gè)獲批準(zhǔn)的基因治療藥物，它是利用腺相關(guān)病毒I型（AAV-I)攜帶外 源基因用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳?。↙PLD)的基因藥物。
[0004] (AAV-2)載體因具有無致病性、宿主范圍廣、目的基因長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)前 基因治療中最有潛力的病毒載體之一。AAV-2基因組全長約4700堿基對(duì)（bp)，兩端為末 端重復(fù)片段（TR)，中間為病毒的結(jié)構(gòu)基因，包括復(fù)制蛋白（R?。┖桶さ鞍祝–ap)基因。 由于存在AAV病毒自身的不穩(wěn)定性及其攜帶外源性基因（治療基因）長度有限等方面缺 陷，因此有必要對(duì)其進(jìn)行基因重組形成重組腺相關(guān)病毒（recombinantadeno-associated virus，rAAV)。如何構(gòu)建可用于制備治療疾病的藥物的重組腺相關(guān)病毒及其相關(guān)產(chǎn)品是本 領(lǐng)域技術(shù)人員努力的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提出一種穩(wěn)定性高、攜帶MAGE-A3抗原基因的重 組腺相關(guān)病毒（RecombinantAdeno-associatedvirus;rAAV)載體及構(gòu)建方法與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)問題通過以下的技術(shù)方案予以解決：
[0007] -種攜帶MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體，是將腺相關(guān)病毒載體中的腺 相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)基因替換為MAGE-A3抗原基因得到的重組腺相關(guān)病毒載體。
[0008] 優(yōu)選地，還可以將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的p5啟動(dòng)子替換為下述三種啟動(dòng) 子中的一種：巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和SV40早期啟動(dòng)子。
[0009] -種攜帶MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法，將腺相關(guān)病毒載 體中的腺相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)基因剔除，然后在剔除的位置上插入MAGE-A3抗原基因，得到重 組腺相關(guān)病毒載體。
[0010] 優(yōu)選地，還包括以下步驟：將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的P5啟動(dòng)子替換為下述 三種啟動(dòng)子中的一種：巨噬細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和SV40早期啟動(dòng)子。
[0011] 優(yōu)選地，包括以下步驟：
[0012] 1)改建AAV-2型pBR322質(zhì)粒：使用限制性內(nèi)切酶Bst98I和Hpa I將AAV-2型 PBR322質(zhì)粒中的AAV-2型腺相關(guān)病毒中的結(jié)構(gòu)基因切除，然后將含有限制性內(nèi)切酶EcoR I 和EcoR V酶切位點(diǎn)的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入所述AAV-2型pBR322質(zhì)粒 中，保留兩端的TR序列或分別在兩端完整的TR序列的第75位核苷酸序列處均插入9個(gè)核 苷酸CTGCGCTGG組成的片段；
[0013] 2)將啟動(dòng)子插入步驟1)得到的改建的AAV-2型pBR322質(zhì)粒中，構(gòu)建攜帶有啟動(dòng) 子的AAV-2型pBR322質(zhì)粒；所述啟動(dòng)子為下述四種啟動(dòng)子中的一種：p5啟動(dòng)子、巨噬細(xì)胞 病毒啟動(dòng)子、P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和SV40早期啟動(dòng)子；
[0014] 3)獲取MAGE-A3cDNA;
[0015] 4)將步驟2)構(gòu)建的所述攜帶有啟動(dòng)子的AAV-2型pBR322質(zhì)粒和步驟3)得到的 MAGE-A3cDNA分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行DNA連接反應(yīng)，得到 攜帶有所述啟動(dòng)子和MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟3)中包括以下步驟：31)從MAGE-A3抗原陽性的腫瘤組織中提 取總mRNA，由總mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成總cDNA;32)以所述總cDNA為模板，在引物1: GTGCTCAGACTCACTCTT和引物2 :AGTCATCATGCCTCTTGA的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所述 MAGE-A3cDNA〇
[0017] -種與攜帶MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品，包括MAGE-A3 重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體、MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的病毒載體、被所述MAGE-A3重組腺 相關(guān)病毒的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系；所述MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體由所 述的或者所述的構(gòu)建方法制得的攜帶MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體制得；所述 MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的病毒載體由所述MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體進(jìn)行細(xì)胞 培養(yǎng)得到。
[0018] -種與攜帶MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品的制備方法，
[0019] MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體的制備：將所述的或者所述的構(gòu)建方法制得 的攜帶MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體導(dǎo)入基因工程大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì) 胞，用含100yg/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選，挑取白色單菌落，提取質(zhì)粒并純 化，得到MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體；
[0020] MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的病毒載體的制備：以所述MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的 質(zhì)粒載體和PHelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAVp細(xì)胞得到MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的病毒載體；
[0021] MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的制備：用所述 MAGE-A3重組腺相關(guān)病毒的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞，所述細(xì)胞系包括 單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系。
[0022] -種所述的攜帶MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體或者所述的相關(guān)產(chǎn)品 在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果是：
[0024] 本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定性高、攜帶外源性基因（MAGE-A3)的重組腺相關(guān)病毒（以 下將"攜帶MAGE-A3抗原基因的重組腺相關(guān)病毒"稱為AAV/MAGE-A3)載體。本發(fā)明的重組 腺相關(guān)病毒載體可將其攜帶的MAGE-A3抗原基因輸送入單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系中，存在 MAGE-A3抗原基因的細(xì)胞被用于刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞（不局限于T淋巴細(xì)胞和B淋巴 細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)證明，被本發(fā)明的AAV/MAGE-A3的病毒載體感染的樹突狀細(xì)胞所誘導(dǎo)的細(xì)胞 毒性T淋巴細(xì)胞在患者體內(nèi)可有效地抑制相關(guān)惡性腫瘤細(xì)胞的生長或者殺滅腫瘤細(xì)胞，因 而，本發(fā)明的AAV/MAGE-A3載體或與本發(fā)明AAV/MAGE-A3載體相關(guān)的產(chǎn)品可被用于制備抗 MAGE-A3陽性的惡性腫瘤的細(xì)胞免疫治療。本發(fā)明在惡性腫瘤的臨床治療和應(yīng)用中具有重 要的理論和實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的AAV/MAGE-A3載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 圖2為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的構(gòu)建AAV/MAGE-A3載體以及制備具有感染性的AAV/ MAGE-A3的病毒載體的流程圖。
[0027] 圖3為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的AAV/MAGE-A3載體的PCR鑒定結(jié)果圖。
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