一種利用生物轉(zhuǎn)化法制備γ-氨基丁酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及y-氨基丁酸的制備，具體涉及一種利用生物轉(zhuǎn)化法制備y-氨基丁 酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]y_氨基丁酸（y-aminobutyricacid，GABA)是一種廣泛存在于動植物體中的天 然非蛋白質(zhì)氨基酸。在哺乳動物體內(nèi)，Y-氨基丁酸作為腦和脊髓中的重要抑制性神經(jīng)遞 質(zhì)，由谷氨酸（Glutamicacid，Glu)在谷氨酸脫駿酶（Glutamatedecarboxylase，GAD，EC 4.I.I. 15)的作用下催化脫羧轉(zhuǎn)化而來，并參與多種代謝活動，具有很高的生理活性，具有 降血壓、調(diào)節(jié)心律失常、改善睡眠、抗焦慮、改善脂質(zhì)代謝、防止動脈硬化等功效，因此受到 越來越多的科學(xué)工作者的關(guān)注。在日本，這類富含GABA的功能性食品的研究取得了較大的 進展。大久長范、津志田藤二郎等人分別利用富集技術(shù)以糙米、米胚芽、茶葉、大豆等為食品 原料成功研制出了GABA大米、GABA茶等產(chǎn)品。2009年，GABA被我國當時的衛(wèi)生部列為新 資源食品（現(xiàn)更名為新食品原料）。
[0003] GABA的制備方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。常見的化學(xué)合成法是將鄰苯 二甲酰亞胺鉀和4-氯丁氰進行反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)過濃硫酸回流水解后結(jié)晶提純得到，其反應(yīng)如 下：
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[0005] 此外還有以吡咯烷酮作為原料，經(jīng)過氫氧化鈣和碳酸氫銨水解開環(huán)制得GABA，反 應(yīng)如下：
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[0007] 雖然通過化學(xué)合成方法來制備GABA具有反應(yīng)速度快的優(yōu)勢，但由于其合成成本 較高，而產(chǎn)率較低，并且在其生產(chǎn)工藝中使用了危險溶劑、甚至有毒溶劑，因而化學(xué)合成法 制備的GABA不能用于食品，也不能被認為是天然的食品添加劑。
[0008] 微生物發(fā)酵法主要是通過具有高活性GAD的微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA。發(fā)酵法具有生 產(chǎn)條件溫和、易放大、生產(chǎn)成本相對較低等優(yōu)點。中國專利CN102174449B公開了一種高產(chǎn) T_氨基丁酸的生產(chǎn)方法及應(yīng)用，包括菌種分離篩選、叮啶橙一紫外線誘變和N+注入誘變 獲得一株高產(chǎn)T-氨基丁酸（Lactobacillusbrevis)TCCC(CGMCCNO. 3414)菌株；發(fā)酵培 養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化以及采用該菌株的生長細胞發(fā)酵和休止細胞的生物轉(zhuǎn)化相偶聯(lián)生 產(chǎn)T-氨基丁酸；采用膜過濾、吸附樹脂脫色、強酸陽離子樹脂離交、乙醇重結(jié)晶等技術(shù)以 及制備色譜技術(shù)節(jié)能降耗技術(shù)，將Y-氨基丁酸從發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化液中分離出來，提純制 得純度達99%的結(jié)晶y-氨基丁酸。中國專利CN102559552A公開了一種高產(chǎn)y-氨基 丁酸的生產(chǎn)方法及應(yīng)用，其中的高產(chǎn)y-氨基丁酸（GABA)生長棉子糖腸球菌M1，保藏號為 CGMCCNo. 5584。其生產(chǎn)方法包括菌種分離篩選獲得一株高產(chǎn)y-氨基丁酸的（Entercoccus raffinosus)TCCC11660(CGMCCNo. 5584)菌株、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化以及IOL發(fā) 酵罐實驗。中國專利CN104388514A公開了利用一種復(fù)合菌種發(fā)酵制備y-氨基丁酸的 方法，發(fā)酵菌株包括植物乳桿菌ZSM-002、卡斯特酒香酵母ZSM-OOl和保藏號為CCTCCNO: M2014376的根霉（Rhizopusoryzae)zsm_005,其特征在于，以谷物種子或含胚副產(chǎn)物為 原料，經(jīng)清洗消毒、Y-氨基丁酸富集、分離提取、精制與純化等過程制備高濃度液態(tài)Y-氨 基丁酸產(chǎn)品，液態(tài)T-氨基丁酸經(jīng)干燥過程制備高濃度固態(tài)T-氨基丁酸產(chǎn)品。中國專利 CN103555779B公開了利用一種發(fā)酵生產(chǎn)y-氨基丁酸的方法，是將兩種谷氨酸脫羧酶基 因gadBl，gadB2構(gòu)建共表達載體導(dǎo)入到谷氨酸生產(chǎn)菌中構(gòu)建基因工程菌，利用基因工程菌 表達的谷氨酸脫羧酶將其自身積累的谷氨酸脫去一個羧基合成出Y-氨基丁酸的復(fù)合菌 種發(fā)酵制備Y-氨基丁酸的方法。通過對種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化，尤其是 尿素在6-24小時內(nèi)間斷補加，大大提高了GABA的產(chǎn)量和谷氨酸轉(zhuǎn)化率。上述已經(jīng)公開的 專利無論是經(jīng)分離、誘變得到的純化菌株還是經(jīng)改造的工程菌株；無論是單一菌種發(fā)酵還 是混合菌種發(fā)酵，其發(fā)酵法生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法仍然存在以下幾個方面的問題：（1)發(fā) 酵周期長，一般需要幾十到上百小時；（2)發(fā)酵過程放熱量大，冷卻循環(huán)水用量大，能耗高； (3)發(fā)酵液組成比較復(fù)雜，提取成本較高；(4)廢渣產(chǎn)量相對較大，菌體過濾困難，活性炭、 珍珠巖等物質(zhì)用量大，副產(chǎn)物給企業(yè)帶來處理壓力。
[0009] 而采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)GABA可以提高底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品純度，具有節(jié)約生產(chǎn) 成本、縮短生產(chǎn)周期及降低環(huán)境污染等諸多優(yōu)點。中國專利CN104031951A公開了一種利 用乳酸菌靜息細胞發(fā)酵生產(chǎn)T-氨基丁酸工藝，利用經(jīng)過誘導(dǎo)的乳酸菌活性靜息細胞體， 分散于含有底物的轉(zhuǎn)化緩沖液中，在合適的條件下轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Y-氨基丁酸；利用該方法可 以大幅度縮短轉(zhuǎn)化時間，提高轉(zhuǎn)化效率，產(chǎn)物成份簡單，利于分離提純，且轉(zhuǎn)化無需無菌條 件，設(shè)備要求簡單，耗能低；經(jīng)條件優(yōu)化，本工藝已適合工業(yè)化生產(chǎn)。中國專利CN103320362 A-株產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的菌株及用其生產(chǎn)Y_氨基丁酸的方法，提供了一株從泡菜中篩選 而來的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)SK30. 001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏編號為CCTCCN0:M2013250,并提供了一種利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)y-氨基丁酸的 方法，該方法包括：(a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中對該菌株進行培養(yǎng)，以得到該植物乳桿菌菌體；(b) 用植物乳桿菌菌體轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成T-氨基丁酸；（c)y-氨基丁酸的分離純化。上述公 開的專利仍然存在Y-氨基丁酸產(chǎn)量低、轉(zhuǎn)化時間長、轉(zhuǎn)化率低等缺陷，效果不太理想。
[0010] 因此，探索一種Y-氨基丁酸產(chǎn)量高、轉(zhuǎn)化時間短、轉(zhuǎn)化率高的直接利用高產(chǎn)菌株 菌體轉(zhuǎn)化MSG制備GABA的方法仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員的不懈追求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有直接利用高產(chǎn)菌株菌體轉(zhuǎn)化制備y-氨基 丁酸的方法的缺陷，以具有高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸鈉（MSG)或谷氨酸（GLu)為y-氨基丁酸 (GABA)能力的短乳桿菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 3414為出發(fā)菌株，經(jīng)增殖培養(yǎng) 和濕菌體收集，將濕菌體重懸于科學(xué)復(fù)配L-谷氨酸鈉（MSG)、谷氨酸（GLu)混合物的緩沖溶 液中，加入對菌株所產(chǎn)胞內(nèi)酶具有較強激活作用的Na2B4O7 ?IOH2O或MgSO4，以最大限度地發(fā) 揮胞內(nèi)酶的活性，將L-谷氨酸鈉（MSG)、谷氨酸（GLu)混合物催化、轉(zhuǎn)化為y-氨基丁酸，再 加上與緩沖溶液中其它成分的科學(xué)復(fù)配、協(xié)同作用，大大提高了L-谷氨酸鈉（MSG)和谷氨 酸（GLu)的摩爾轉(zhuǎn)化率和y-氨基丁酸的產(chǎn)量。
[0012] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0013] -種利用生物轉(zhuǎn)化法制備y-氨基丁酸的方法，包括如下步驟：
[0014] 1)將保存完好的短乳桿菌CGMCCNO. 3414的斜面菌種活化1-3次，接種1-2環(huán)于 種子培養(yǎng)基中，30_35°C靜置培養(yǎng)12h后，以5-20% (V/V)的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中， 30-35°C靜置培養(yǎng)16-72h得發(fā)酵液；
[0015] 進一步地，所述種子培養(yǎng)基組成為：玉米糖化液15-30g，蛋白胨5-15g，酵母浸出 粉5-10g，檸檬酸銨l-5g，硫酸鎂0. 3-1. 0g，硫酸錳0. 1-0. 5g，乙酸鈉l-4g，磷酸二氫鉀 l_4g，蒸餾水1000 mL,pH值 6. 0;
[0016] 進一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米糖化液20_30g，酵母浸出粉10_20g， 玉米漿10-30g，乙酸鈉l-4g，磷酸鉀l-4g，硫酸鎂0. 2-0. 8g，硫酸銨0. 1-0. 5g，蒸餾水 1000 mL,pH值 6. 0;
[0017] 2)將發(fā)酵液于4°C、5000r/min離心lOmin，然后用無菌水洗滌、離心，重復(fù)3次，收 集濕菌體；
[0018] 3)向每升pH值為4. 5-5. 0的緩沖溶液中加入收集得到的濕菌體25-75g、底物 70-320g、磷酸吡哆醛 0? 05-0. 3mmol、Na2B4O7 ?IOH2O或MgSO4 0? 14-0. 72g、表面活性劑 0. 5-2g，均勻混合，于溫度25-55°C、轉(zhuǎn)速150-200r/min催化轉(zhuǎn)化4-12h得到轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液 經(jīng)常規(guī)分離、提取和純化工藝即得純化Y-