用于細胞培養(yǎng)的方法
【專利說明】用于細胞培養(yǎng)的方法 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)的方法。更準確地說，本發(fā)明涉及使用一種或多種IaI(間 a胰蛋白酶抑制劑（inter-alphatrypsininhibitor)或間a抑制劑）蛋白或其部分作 為細胞培養(yǎng)基的組分或細胞培養(yǎng)表面材料上的包被層用于細胞培養(yǎng)的方法。此外，本發(fā)明 涉及細胞培養(yǎng)基和以一種或多種IaI蛋白或其部分提供的細胞培養(yǎng)包被層/基質。
[0002] 發(fā)明背景 多能干（PS)細胞例如胚胎干（ES)細胞和誘導性多能干（iPS)細胞具有在長期培養(yǎng)期 間維持多能性并且仍誘導分化成多種譜系的能力，因此潛在地提供用于例如基礎研究、毒 理學篩選、遺傳病癥的體外建模或治療性細胞置換的新的細胞來源。直到可完全實現這些 終點之前，仍有許多障礙要克服。例如尋找支持安全、簡單和穩(wěn)健的衍生化、生長、維持和大 規(guī)模擴增，同時保持這些難以培養(yǎng)的細胞的自我更新的培養(yǎng)條件會是必要的。尤其重要的 是需要用于體外維持人PS細胞的方法。這些方法必須足夠好以維持細胞群而不誘導誘變、 高水平的分化或多能性的喪失。
[0003] 小鼠ES細胞廣泛用于基礎研究以例如研究正常和病理性發(fā)育和功能，且使用這 些細胞獲得的知識常常轉移到人類系統(tǒng)中?，F今使用的大多數小鼠ES(mES)細胞系生長 在補充了選定批次的胎牛血清（FBS)和白血病抑制因子（LIF)的培養(yǎng)基中的預先平板接種 去有絲分裂活性的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF)飼養(yǎng)細胞上。飼養(yǎng)細胞提供支持mES細胞附 著和分泌提高mES細胞生長存活和繁殖的各種生長因子的基質，而FBS提供激素和必需營 養(yǎng)物，以及改變培養(yǎng)基的生理/生理化學性質。LIF顯著提高mES細胞多能性的衍生化和 維持。已衍生出一些mES細胞系，并已適應在含有血清和LIF的培養(yǎng)基中0. 1%明膠包被層 (存在于膠原中的高平均分子量的水溶性蛋白質的異質混合物，并從牛皮膚提?。┥蠠o飼 養(yǎng)細胞生長。這兩種細胞培養(yǎng)方案有缺點，其組分（即FBS、牛血清白蛋白或BSA、明膠）中 的許多不確定，并且是動物來源的。例如，FBS含有各種生長因子和促進ES細胞生長的其 它不確定的組分，但它還表明含有可能影響mES細胞平板接種效率、生長和分化的潛在分 化因子。因此FBS批次需要預先篩選和ES-合格以確保維持mES細胞維持和生長的血清因 子的凈作用超過分化誘導因子的作用。飼養(yǎng)細胞反過來（intheirturm)分泌過多的無法 控制的因子，并且是致病性污染的可能來源。
[0004] 為了加強控制ES細胞實際上遇到什么因子，并且為了避免來自非所需的因子的 干擾，已建立了若干更新的和更確定的方案。在2003年，已表明BMP4可與LIF組合有效 地在不含血清和飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中用于mES衍生化和維持（Qi，Li等人，2004)。在2004 年，開發(fā)了化學上確定的（未描述確切配方）合成的敲除血清替代品（syntheticknockout serumreplacement，K0SR)以替代血清。然而，KOSR在缺乏飼養(yǎng)細胞時不能單獨支持mES 單細胞培養(yǎng)。在2008年，表明了mES可在缺乏血清和飼養(yǎng)細胞時作為自由漂浮的球體保持 在含LIF和bFGF(堿性成纖維細胞生長因子）的N2補充培養(yǎng)基，本文稱為ESN2培養(yǎng)基中 (Andang，Moliner等人，2008,Moliner，Enfors等人，2008)。
[0005] 最近，加入B27和N2補充培養(yǎng)基中的補充2種抑制劑，促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)/胞外信號調節(jié)激酶（ERK)激酶（MEK)抑制劑H)0325901和糖原合酶激酶3 (GSK3) 抑制劑CHIR99021的另一種確定的培養(yǎng)基（本文稱為2i培養(yǎng)基）顯示，在不加入外源因子 的情況下維持mES細胞自我更新（Ying，Wray等人，2008)。培養(yǎng)在2i培養(yǎng)基中的小鼠ES細 胞仍對LIF起反應，所述LIF提高克隆效率和增殖速率。這個培養(yǎng)方案的缺點是在血清不存 在時，細胞不附著于組織培養(yǎng)板，而替代地作為自由漂浮的球體生長（Tamm，PijuanGalito 等人，2013);而且，mES細胞的生長速率降低。
[0006] 人PS(hPS)細胞及其分化細胞最常被在含有動物來源的組分的存在的表面或培 養(yǎng)基的存在下培養(yǎng)，所述組分例如飼養(yǎng)層（小鼠來源的（通常為MEF)和人來源的（通常人 包皮成纖維細胞或HFF)二者）、Matrigel? (Engelbreth-Holm-SwarmEHS腫瘤的可溶性基 底膜提取物）、敲除血清替代品（KOSR)和/或衍生物如BSA。加入培養(yǎng)環(huán)境的這些動物來 源的試劑使細胞暴露于潛在有害的病毒或其它感染劑中，其可能轉移給患者或損害hPS細 胞的一般培養(yǎng)和維持。另外，這類生物制品對于批次改變、免疫應答和有限的存放期是脆弱 的，并且如果細胞待用于細胞療法，則細胞暴露于來自其它物種的分子還產生可在接受者 中產生免疫應答的改變。
[0007] 迄今為止，已描述了幾個利用化學上確定的培養(yǎng)基和合成的或確定的表面的完 全重組的無異源物（xeno-free)系統(tǒng)。人PS細胞培養(yǎng)中的最新成就發(fā)表于2011年的 Nature方法，其描述了化學上減少且完全確定的培養(yǎng)基，名為E8,只含8種不同的化學組 分，可支持hiPS細胞衍生化和在Matrigel?或基于玻連蛋白的表面上更成功的培養(yǎng)（Chen， Gulbranson等人，2011)。即使如此，當使用確定的培養(yǎng)基時，不同的細胞系和不同的實驗 室仍獲得不同的結果，而且最廣泛使用的方案對于hPS細胞依然是Matrigel?和mTESRl? (其含有從FBS純化的BSA)的組合；對于mES細胞為明膠包被層和補充FBS的培養(yǎng)基。而 且，如果不是在ROCK抑制劑分子（即Y-27632)的存在下，hPS細胞不能作為單細胞分裂 (Watanabe，Ueno等人，2007)，并且對于常規(guī)傳代需要使用和緩分離技術以團塊分裂，這證 實了胞外環(huán)境對多能干細胞的關鍵作用。
[0008] 仍急需了解未分化未突變的多能干細胞的生長和維持所必需的所有不同的組分。 重要的是得到胞外基質（ECM)和培養(yǎng)基因子的正確組合用于最佳維持，特別用于人PS細胞 系，否則細胞顯示低的附著率、存活率和增殖速率以及高的分化水平。
[0009] 為了細胞存活和增殖速率，用于細胞培養(yǎng)的當前方案在細胞培養(yǎng)基中仍使用FBS 或衍生物例如BSA，因此，仍需要不損害細胞、培養(yǎng)條件或多能性的改良的無血清方案。
[0010] 發(fā)明概述 在本發(fā)明中，我們發(fā)現促進細胞黏著和長期細胞培養(yǎng)活力的因子。更準確地說，本發(fā)明 提供在部分或完全化學上確定的培養(yǎng)基存在下，間a胰蛋白酶抑制劑（laI)家族蛋白質 或其部分，具體地說HC2 (重鏈2)作為表面包被層和/或培養(yǎng)基添加劑用于細胞黏著和長 期培養(yǎng)、多能干細胞的維持和生長至少20次傳代，而不誘導顯而易見的分化或核型異常的 新的用途。
[0011] 因此，第一方面，本發(fā)明提供用于干細胞或祖細胞培養(yǎng)的方法，所述方法包括將來 自IaI(間a胰蛋白酶抑制劑）蛋白質家族的一種或多種蛋白質或其部分加入細胞的無 血清培養(yǎng)物中。細胞優(yōu)選為干細胞。本發(fā)明的添加會促進自我更新、附著、存活，且在PS細 胞的情況下，還促進多能性。IaI蛋白或其部分自血清分離、作為重組蛋白產生或以化學方 法合成。
[0012] 細胞優(yōu)選為黏著細胞，而在一個優(yōu)選的實施方案中，細胞是PS(多能干）細胞，并 且可為ES(胚胎干）細胞或iPS(誘導多能干）細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞 為人細胞。
[0013] 優(yōu)選IaI蛋白或其部分選自IaI(laIHC1、IaIHC2和尿抑胰酶素）或 IaIH2，B?？梢允褂肐aI蛋白的重鏈，例如來自IaI的重鏈2 (HC2)。
[0014] 在PS細胞的情況下，優(yōu)選細胞培養(yǎng)是無血清的。
[0015] 在一個實施方案中，IaI蛋白或其部分作為包被劑包被在細胞培養(yǎng)表面，所述表 面例如塑料、載體、支架、基質或網。
[0016] 在另一個實施方案中，將IaI蛋白或其部分加入無血清細胞培養(yǎng)基中。
[0017] IaI蛋白或其部分的濃度為〇?I)ig/ml-200Pg/ml、優(yōu)選2-100Pg/ml、最優(yōu)選 10-50 噸/ml培養(yǎng)基或包被溶液。
[0018] 本發(fā)明的方法適于在至少20次傳代期間不誘導細胞分化或突變的細胞培養(yǎng)。在 細胞培養(yǎng)后，可制備/提供PS細胞用于例如細胞療法、藥物篩選和毒性測定法。
[0019] 第二方面，本發(fā)明提供包含濃度為〇?IKg/ml-200Pg/ml、優(yōu)選2-100Pg/ml、最優(yōu) 選10-50 呢/ml的IaI蛋白或其部分的細胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基。
[0020] 第三方面，本發(fā)明提供包含以上述濃度含有IaI蛋白或其部分的