4-[6-乙基-4-(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-O-β-D-吡喃葡萄糖基丁酸及其藥物組合物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，涉及一個新的4-(lH)-吡啶酮葡萄糖苷類化 合物，以其為活性成分的治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物，其制備方法，及其在制藥中的 應(yīng)用，特別是在制備抗乙型病毒性肝炎的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（h印atitisBvirus，HBV)引起呈慢性攜帶狀 態(tài)的傳染病。慢性乙型病毒性肝炎（chronichepatitisB，CHB)是引發(fā)肝硬化、肝癌的主要 病因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)統(tǒng)計，全世界共有20億HBV攜帶者，其中CHB患者約3. 5 億；中國HBV攜帶約1. 2億人，CHB患者超過3000萬（林永煥.乙型肝炎預(yù)防與治療[M]. 北京：科學技術(shù)文獻出版社，2007.;LavanchyD.JViralH印atitis. 2004, 11，97-107.)。 現(xiàn)有的抗HBV藥物（主要包括疫苗、干擾素和核苷類）的療效已得到確認，其中疫苗以預(yù)防 為主，對已感染者無效；干擾素和核苷類藥物因副作用明顯、易產(chǎn)生耐藥性、作用靶點單一 等原因遠不能滿足臨床需要（AntonioC?，等?JHepatol. 2006, 44, 77-83;LvZ.L?，等?J MedChem. 2010, 53, 660-668.;吳劍涓.天津藥學.2006,18,49-52.)。目前乙型肝炎依舊 是威脅全世界人類健康的重要問題，結(jié)構(gòu)和作用機制新穎的抗HBV藥物仍然是全球藥物研 發(fā)的熱點。
[0003] 天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，從中尋找高效低毒、作用靶點新穎的先導(dǎo)化合物已經(jīng) 成為新型抗KW藥物研發(fā)的重要組成部分。茵陳為菊科植物濱蒿Artemisiascoparia Waldst.etKit?或茵陳蒿ArtemisiacapillarisThunb?的干燥地上部分。中醫(yī)認為 其氣芳香，有清濕熱，退黃疸的功效，臨床上主要用來治療黃疸尿少、濕瘡瘙癢、黃疸型傳 染性肝炎等癥狀?！吨袊幍洹分惺珍浀亩喾N治療乙肝的中藥制劑（乙肝寧顆粒、乙肝養(yǎng) 陰活血顆粒、小兒肝炎顆粒、護肝片、利肝隆顆粒、肝炎康復(fù)丸、茵芪肝復(fù)顆粒、茵梔黃口服 液、茵膽平肝膠囊、黃疸肝炎丸、清肝利膽膠囊等）中均以茵陳作為主要藥效組分（中國 藥典，2010版）。研究表明茵陳中主要含有香豆素，烯炔，黃酮，三萜，留體，長鏈脂肪族化 合物，及揮發(fā)油等（Wu，T.S?，等.BioorgMedChem.2001，9,77_83;0kuno，I?，等.Chem PharmBull. 1988,36,769-775)。然而，現(xiàn)有文獻中對于這些化合物活性的報導(dǎo)主要集 中在保肝利膽方面，其抗HBV活性研究較少，僅見2014年趙勇等從茵陳蒿中分離得到系 列倍半萜、綠原酸衍生物、三萜、黃酮、木質(zhì)素和酚酸類成分具有一定的體外抗HBV活性 (ZhaoY?，等?Fitoterapia. 2014,95, 187-193.;ZhaoY?，等?J.Ethnopharmacol. 2014， 156,147-154.)〇
[0004] 迄今，現(xiàn)有技術(shù)中無化合物4-[6_乙基-4_(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-〇_f3 -D-吡 喃葡萄糖基丁酸（1)的報道，也沒有其作為有效成分的藥物組合物的報道，也沒有該化合 物及其藥物組合物在制備治療乙型病毒性肝炎的藥物中的應(yīng)用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一類新的具有藥用價值的化合物4_[6_乙基-4-(lH)_吡 啶酮-2-基]-3R-0-P-D-吡喃葡萄糖基丁酸（1)，含有治療乙型病毒性肝炎有效量的化合 物1及藥用載體或賦形劑的藥物組合物，化合物1及其藥物組合物的制備方法，化合物1或 其藥物組合物在制備抗乙型病毒性肝炎的藥物中的應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0007] 結(jié)構(gòu)式⑴所示的化合物4-[6_乙基-4-(lH)-吡啶酮-2-基]-3R-〇-f3 -D-吡喃 葡萄糖基丁酸（1)，
[0008]
[0009] 藥物組合物，其中含有治療有效量的式（I)化合物1和藥學上可接受的載體。
[0010] 用于治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物，其中含有治療有效量的式（I)化合物1 和藥學上可接受的載體。
[0011] 如所述的藥物組合物，為治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物。
[0012] 所述的式（I)化合物1在制備治療人類疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 如所述的應(yīng)用，其中所述的疾病是乙型病毒性肝炎。
[0014] 所述藥物組合物在制備治療人類疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 如所述的應(yīng)用，其中所述的疾病是乙型病毒性肝炎。
[0016] 制備權(quán)利要求1所述式（I)化合物1的方法，取茵陳蒿（Artemisiacapillaris) 或濱蒿（Artemisiascoparia)干燥全草，粉碎，用90%乙醇回流提取兩次，每次3小時，合 并乙醇提液，減壓回收乙醇得浸膏，浸膏用80%乙醇溶解吸附于硅膠上，室溫放置揮干溶 劑，研碎過篩后經(jīng)硅膠柱層析，用9:1:0、9:1:0. 1、8:2:0. 2、6:4:0. 4的氯仿-甲醇-水梯 度洗脫，得到5個組分A-E，組分D經(jīng)過MCICHP-20Pgel柱中壓制備，20:80至80:20的 乙腈-水梯度洗脫，得到5個流份D-1~D-5。D-4經(jīng)硅膠柱層析，以乙酸乙酯-甲醇-水 8:2:0. 2洗脫，得到兩個流分D-4-1和D-4-2,D-4-1經(jīng)Rp-Cls柱中壓制備，乙腈-水20:80 洗脫，純化得到化合物1。
[0017] 制備含4_[6_乙基-4-(lH)_吡啶酮-2-基]-3R-〇_f3 -D-吡喃葡萄糖基丁酸（1) 的藥物組合物的方法是以化合物4- [6-乙基-4- (1H)-吡啶酮-2-基]-3R-0- 0 -D-吡喃葡 萄糖基丁酸（1)為原料，加入可藥用載體或賦形劑。
[0018] 本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物 組合物含有0. 1~99 %，優(yōu)選為0. 5~90 %的本發(fā)明化合物，其余為藥物學上可接受的，對 人和動物無毒和惰性的藥物制劑常用的藥用載體和/或賦形劑。將本發(fā)明的藥物組合物以 單位體重服用量的形式使用。
【附圖說明】：
[0019] 圖1為4-[6_乙基-4-(lH)_吡啶酮-2-基]-3R-〇-f3 -D-吡喃葡萄糖基丁酸（1) 的2DNMR相關(guān)和ECD譜；
[0020] 圖2為化合物4-[6_乙基-4_(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-〇-f3 -D-吡喃葡萄糖基丁 酸（1)的結(jié)構(gòu)式。
【具體實施方式】：
[0021] 為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的試驗例和實施例來進 一步說明本發(fā)明化合物4-[6-乙基-4-(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-0-0 -D-吡喃葡萄糖基丁 酸（1)的藥理作用結(jié)果，以及本發(fā)明的制備方法及藥物組成，但并不以此試驗例和實施例 來限定本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容。
[0022] 試驗例1 :
[0023] 4-[6_乙基-4-(lH)_吡啶酮-2-基]-3R-〇-f3 -D-吡喃葡萄糖基丁酸⑴對乙肝 病毒表面抗原（HBsAg)和乙肝病毒e抗原（HBeAg)的分泌以及乙肝病毒DNA(HBVDNA)復(fù) 制的抑制作用以及對ffepG2. 2. 15細胞的細胞毒性。
[0024] 1材料和方法
[0025] 1. 1材料：4-[6_乙基-4_(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-0-P-D-吡喃葡萄糖基丁 酸（1);泰諾福韋（江西晨陽藥業(yè)有限公司）；HepG2.2. 15細胞（廣州空軍醫(yī)院）；高糖 DMEM(GIBCO) ;G418(GIBIC0);胎牛血清（GIBICO) ;L-谷氨酰胺（AMRESC0);青霉素，鏈霉 素[石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司]。
[0026] 1. 2 儀器：酶標儀Bio-RAD68〇 (美國）；C02培養(yǎng)箱ThermoForma3：310 (美國）； 倒置生物顯微鏡XD-101型（南京）；熒光定量PCR儀Mastercycler印realplex型（德 國eppendorf公司）；低溫高速離心機Centrifuge541f5D型（德國eppendorf公司）。
[0027] 1. 3實驗過程：HepG2. 2. 15細胞生長培養(yǎng)基組成為高糖DMEM，10%的胎牛血清， 0. 03%L-谷氨酰胺，100mg/LG418, 100IU青霉素以及100IU鏈霉素。維持液組成為高糖 DMEM，2%的胎牛血清，0. 03%L-谷氨酰胺，100mg/LG418，100IU青霉素以及100IU鏈霉 素。供試藥物由維持液稀釋配制成一定濃度的含藥培養(yǎng)基。將胰酶消化后的單細胞懸液接 種于細胞板上，于48h后換為含藥培養(yǎng)基，每種藥物用維持液四倍稀釋為四個藥物濃度，同 時設(shè)置只加維持液的細胞對照組，并以泰諾福韋做陽性藥物對照。用MTT法測定藥物對細 胞的毒性；用酶聯(lián)免疫法測定HBsAg和HBeAg載量，用熒光定量PCR法檢測HBVDNA載量。
[0028] 1. 3. 1藥物細胞毒性測定：
[0029] 根據(jù)Mosmann建立的MTT法檢測藥物的細胞毒性。具體方法是：IfepG2. 2. 15細 胞接種于48孔板，3X104細胞每孔，加入生長培養(yǎng)基，于5%C02, 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，吸 除原培養(yǎng)基，加入不同濃度含藥培養(yǎng)基，于5%C02, 37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后吸除培養(yǎng) 基，按0. 2mL每孔加入濃度為0. 8mg/mL的MTT，于37°C5%C0J?育4h后棄上清，每孔中加 入0. 2mL二甲基亞砜，于37°C孵育10min，至生成的藍紫色結(jié)晶物完全溶解，在酶標儀上測 定溶液在490nm下的吸光度值。根據(jù)結(jié)果計算藥物對細胞的破壞百分率：
[0030] n destroy = (A細胞對醒-A供試樣品組)/細胞對醒-A空白組)X100%。
[0031] 1. 3. 2抑制HBsAg和HBeAg分泌活性的測定：
[0032] 利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗）法，測定樣品對HBsAg和HBeAg抑制活性。IfepG 2. 2. 15細胞接種于48孔板，3X104細胞每孔，加入生長培養(yǎng)基，于5%C02,37°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)72h，吸除原培養(yǎng)基，加入不同濃度含藥培養(yǎng)基，于5%C02,37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。取上 清液，分別利用HBsAg和HBeAg試劑盒檢測。利用酶標儀測定溶液在的吸光度值（490nm)。
[0033] 抑制率Hinhibitory= (A細胞對照組-A供試樣品組）/ (A細胞對照組-A空白組）X100%
[0034] 1(：5。=411衍18[(50-〈50%抑制率）八>50%抑制率-〈50%抑制率）\18(稀釋 倍數(shù)）+lg(〈50 %抑制率的濃度）]
[0035] SI=CC50/IC50
[0036] 1. 3. 3抑制HBVDNA復(fù)制活性的測定：
[0037] 具體方法是：IfepG2. 2. 15細胞按5X105個每孔接種于24孔細胞板，于 5%C02,37°C培養(yǎng)箱中用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，72h后更換為含藥培養(yǎng)基，48h后繼續(xù)以含 藥培養(yǎng)基更換原培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。使用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒 (TIANampGemomicDNAKit，TIANGEN，China)提取細胞DNA。用HBV核酸定量檢測試劑盒 (QIAGEN,Co.，Ltd,Shenzhen)熒光定量PCR法定量檢測HBVDNA載量。取2yLDNA樣品， 加入 37.6yLHBVPCR反應(yīng)液，0.4yLTaq酶，0.06yLU