，過濾后，將得到的濾液過填料的粒徑大小為200目的硅膠柱色譜，然后依次用體積比為 10:1~2:1的石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，得到各洗脫部位，收集體積比為3:1的石油 醚-乙酸乙酯洗脫餾分，并將該餾分過填料的粒徑大小為300目硅膠柱色譜，然后依次用體 積比為5:1~2:1的石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，得到各洗脫部位，再次收集梯度洗脫 體積比為3:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分，并將該餾分再次過S印hadex LH-20凝膠吸附 樹脂柱色譜，用MeOH (50-100% )進(jìn)行梯度洗脫，將S印hadex柱的75% MeOH洗脫部位通過 硅膠柱色譜，以體積比8 : I : 1的乙酸乙酯-乙醇-水進(jìn)行洗脫，洗脫液真空濃縮至浸膏 狀物，并將浸膏狀物在60°C下真空減壓干燥，干燥完成即得淡黃色粉末狀單體化合物I。
[0019] 實施例3: 取11. Okg干燥的薺菜地上部分作為原料，粉碎機(jī)粉碎后，向原料粉末中加入質(zhì)量濃度 為70%的乙醇溶液進(jìn)行超聲提取3次，每次40min，提取結(jié)束后合并所有濾液，經(jīng)低溫減壓濃 縮至無溶劑，得提取浸膏I l〇〇g，將得到的提取浸膏超聲分散混懸于蒸餾水中，之后，依次用 石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對分散液進(jìn)行萃取，并將所得各部位萃取液減壓濃縮得到石油 醚部位105. 3g、乙酸乙酯部位236. lg、正丁醇部位318. 5g，結(jié)合前期的藥理篩選結(jié)果，有針 對性地對薺菜活性部位一一乙酸乙酯部分進(jìn)行分離，將所得的乙酸乙酯部位超聲分散于水 中，過濾后，將得到的濾液過填料的粒徑大小為200目的硅膠柱色譜，然后依次用體積比為 10:1~2:1的石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，得到各洗脫部位，收集體積比為3:1的石油 醚-乙酸乙酯洗脫餾分，并將該餾分過填料的粒徑大小為200目硅膠柱色譜，然后依次用體 積比為5:1~2:1的石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，得到各洗脫部位，再次收集梯度洗脫 體積比為3:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分，并將該餾分再次過S印hadex LH-20凝膠吸附 樹脂柱色譜，用MeOH (50-100% )進(jìn)行梯度洗脫，將S印hadex柱的75% MeOH洗脫部位通過 硅膠柱色譜，以體積比9 : 2 : 1的乙酸乙酯-乙醇-水進(jìn)行洗脫，洗脫液真空濃縮至浸膏 狀物，并將浸膏狀物在55°C下真空減壓干燥，干燥完成即得淡黃色粉末狀單體化合物I。
[0020] 本發(fā)明制備的化合物I為淡黃色粉末（甲醇)，HR-ESI-MS餘々513.6238 [M+Na] + 提示其分子組成為C24H26On (calcd. for C24H26O11Na, 513. 6235)，不飽和度為12。經(jīng)測定： 化合物 I 的 UV (MeOH) inax: 270,336 nm;IRKnax: 3441.0，1656.7，1601.8，1084.2 cm1; 1H NMR (DMS0-4,400 MHz)和 13C NMR (DMSO-4,100MHz)數(shù)據(jù)見圖 1 的表 1 所示。根據(jù)化 合物I的波譜數(shù)據(jù)和HMBC、N0ESY、1H-1H COSY等偶聯(lián)相關(guān)(如附圖2所示)，最終解析確定 化合物I為一個5-羥甲基新黃酮化合物。
[0021] 本發(fā)明所制備的化合物I在抗腫瘤方面的活性實驗研究： (1) 實驗細(xì)胞： BGC-823 (人胃癌細(xì)胞)、A2780 (人卵巢癌細(xì)胞)、A549 (人肺癌細(xì)胞)、HCT-8 (人結(jié)腸癌 細(xì)胞)、Bel-7402 (人肝癌細(xì)胞） (2) 細(xì)胞培養(yǎng)： 選用含有質(zhì)量濃度為10%的牛胎血清、1〇〇 U/mL青霉素和100 mg/L的RRMI1640作為 培養(yǎng)基，將實驗細(xì)胞放在37° C、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)行藥理實驗 時選用對數(shù)生長期細(xì)胞。
[0022] (3) MTT 法： A.取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后充分吹打成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后稀釋成IXlO4 cell/ mL的液體，在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行接種，100成/孔。含有本發(fā)明所制備的單體化合物I的 樣品設(shè)4-5個濃度級別，然后在實驗孔中加入100此不同濃度級別樣品的培養(yǎng)基，每一濃 度級別平行3孔。對照組加入等體積溶劑。
[0023] B.將96孔培養(yǎng)板置于37 ° C、5% 0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時，然后棄去 培養(yǎng)液，每孔加入新鮮配置的含0.20 mg/mLMTT的無血清培養(yǎng)基，在37 ° C下繼續(xù)培養(yǎng)4 小時，然后離心，除去上清液。每孔加入150此二甲基亞砜DMSO溶解formazan沉淀，置微 量震蕩器上震蕩5分鐘使其充分溶解。
[0024] C.在BIORAD 550型酶標(biāo)儀上測定570 nm處的光密度值。按下列公式計算腫瘤 細(xì)胞生成抑制率，再以藥物濃度對腫瘤細(xì)胞生成抑制率作圖得到計量曲線，從曲線上讀取 藥物的半數(shù)抑制濃度（IC 5。）值。腫瘤細(xì)胞生長抑制率（％) = (1-實驗孔測定值/對照孔測 定值）X 100% (4)實驗結(jié)果： 在MTT法測試中，化合物I對HCT-8 (人結(jié)腸癌細(xì)胞)、Bel-7402 (人肝癌細(xì)胞)、 BGC-823 (人胃癌細(xì)胞)、A549 (人肺癌細(xì)胞）及A2780 (人卵巢癌細(xì)胞）等癌細(xì)胞系的IC 5。 (M)分別見附圖3表2所示。
[0025] (5)結(jié)論： 化合物I具有明顯的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用，可作為細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑用 于抗腫瘤的研究。因此，本發(fā)明所述的新黃酮化合物具有制備臨床腫瘤預(yù)防和治療藥物的 前景。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點在于所得化合物為5-羥甲基新黃酮化合物，化合物結(jié)構(gòu)新穎，具有 抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性，并且提取分離方法簡易，便于對其進(jìn)行進(jìn)一步的藥理和臨床研 究，這為開發(fā)療效好且毒副作用小的新型抗腫瘤藥物奠定了重要的理論基礎(chǔ)。
【主權(quán)項】
1. 從薺菜中分離純化的黃酮類化合物，其特征在于，該黃酮類化合物的化學(xué)名稱為： 2-(3, 4-二甲氧苯基）-5-(羥甲基-7-0-f-D，萄糖基-4H-色烯-4-酮，其結(jié)構(gòu)式如下：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從薺菜中分離純化的黃酮類化合物的制備方法，其特征 在于，包括以下步驟： (1) 、取干燥的薺菜地上部分作為原料，粉碎后，向其中加入質(zhì)量濃度為70%的乙醇溶 液進(jìn)行超聲提取20-40min，提取結(jié)束后進(jìn)行過濾，收集濾液，并向得到的濾渣中加入質(zhì)量濃 度為70%的乙醇溶液，重復(fù)上述超聲提取和過濾操作2次，合并所有濾液，減壓濃縮至無溶 劑，得提取浸膏，備用； (2) 、向步驟（1)得到的提取浸膏中加入蒸餾水，超聲分散后得到分散液，之后，依次用 石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對分散液進(jìn)行萃取，并將所得各部位萃取液減壓濃縮得到石油 醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，備用； (3 )、將步驟（2 )所得的乙酸乙酯部位超聲分散于水中，過濾后，將得到的濾液過硅膠柱 色譜，然后依次用體積比為10:1~2:1的石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，得到各洗脫部 位，備用； (4) 、收集步驟（3)中體積比為3:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分，并將該餾分過硅膠 柱色譜，然后依次用體積比為5:1~2:1的石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，得到各洗脫部 位，備用； (5) 、收集步驟（4)中體積比為3:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分，并將該餾分再次過 S印hadexLH-20凝膠吸附樹脂柱色譜，然后依次用質(zhì)量濃度為50%~100%的MeOH溶液進(jìn) 行梯度洗脫，將S印hadex柱的質(zhì)量濃度為75%MeOH洗脫部位通過硅膠柱色譜，以體積比 10-8 : 3-1 : 1的乙酸乙酯-乙醇-水進(jìn)行洗脫，洗脫液真空濃縮至浸膏狀物，并將浸膏狀 物在50-60°C下真空減壓干燥，干燥完成即得淡黃色粉末狀黃酮類化合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從薺菜中分離純化的黃酮類化合物的制備方法，其特征 在于：所述步驟（1)中，每次超聲提取的時間為30min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從薺菜中分離純化的黃酮類化合物的制備方法，其特征 在于：所述步驟（3)中，硅膠柱色譜內(nèi)填料的粒徑大小為100-200目。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從薺菜中分離純化的黃酮類化合物的制備方法，其特征 在于：所述步驟（4)中，硅膠柱色譜內(nèi)填料的粒徑大小為200-300目。6. 權(quán)利要求1所述的從薺菜中分離純化的黃酮類化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及從薺菜中分離純化的黃酮類化合物，包括乙醇超聲提取、溶劑萃取、硅膠柱色譜洗脫分離、樹脂柱吸附、硅膠柱色譜洗脫分離、真空濃縮、真空減壓干燥等步驟。分離出的黃酮類化合物名稱為：2-(3,4-二甲氧苯基)-5-(羥甲基-7-O-<i>β</i>-D<b><i>-</i></b>葡萄糖基-4H-色烯-4-酮。方法本身以藥食兩用的薺菜為原料，來源豐富、價廉易得，制得的5-羥甲基新黃酮化合物結(jié)構(gòu)新穎，具有明顯的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用，可作為細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑用于抗腫瘤的研究。具有很好的開發(fā)利用價值，為今后臨床腫瘤預(yù)防和治療藥物的研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】A61P35/00, C07H17/07, C07H1/08
【公開號】CN105111263
【申請?zhí)枴緾N201510544609
【發(fā)明人】馬勤閣, 魏榮銳, 桑志培, 何朝政, 羅保民, 柳文敏, 周亮, 段翔耀, 李亞萍, 黃紅春
【申請人】南陽師范學(xué)院
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月31日