的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效制備紐莫康定B0的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紐莫康定B。（pneumocandinB。）是由產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物， 在發(fā)酵時(shí)除了會(huì)產(chǎn)生紐莫康定B。以外還會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物A。以及同 分異構(gòu)體C。。作為抗真菌藥物卡泊芬凈的前體化合物，制備高純度的紐莫康定B。對(duì)卡泊芬 凈的精制純化至關(guān)重要。
[0003] 中國(guó)發(fā)明專利200910133118. 0公開(kāi)了制備紐莫康定B。的方法，主要步驟是：a) 離心紐莫康定B。發(fā)酵液，取菌絲體，用甲醇浸提紐莫康定B。山）將甲醇浸提液蒸干，再用正 丁醇浸提紐莫康定B。；c)將正丁醇浸提液蒸干，再用70~80%甲醇浸提紐莫康定B。，過(guò)酸 性氧化鋁柱，收集流出液；d)將紐莫康定B。收集蒸干后，用60~70%甲醇溶解，上HP20吸附 樹(shù)脂，用85~95%甲醇洗脫，收集洗脫液紐莫康定B0純度在50~65%間；e)將紐莫康定B。收 集液蒸干，溶于反相樹(shù)脂YPR-II，用85~95%甲醇洗脫，收集紐莫康定B。純度大于90% ;f) 將紐莫康定B。收集液蒸干后，用甲醇溶解，滴加少量水使之過(guò)飽和結(jié)晶析出，制得紐莫康定 B。 ，純度可達(dá)到96%。該方法沒(méi)有對(duì)同分異構(gòu)體C。進(jìn)行檢測(cè)和純度控制，而一般發(fā)酵液中的 C。 雜質(zhì)含量在10%左右，該方法得到的是B。和C。的混合物，在下一步的合成反應(yīng)中將嚴(yán)重 影響卡泊芬凈的質(zhì)量。
[0004] 中國(guó)專利201410051009. 5公開(kāi)了一種高效制備紐莫康定B。的方法，主要包括：a) 將含有紐莫康定B。的發(fā)酵液pH調(diào)至2. 0~4. 0,過(guò)濾，浸提紐莫康定B。的浸提液；b)浸提液 濃縮后加入硅藻土裹晶，再加入水?dāng)嚢?，離心；c)離心固體用乙醇溶解，加入活性炭脫色過(guò) 濾；d)濾液濃縮，加入氯仿過(guò)硅膠柱，收集紐莫康定B。的過(guò)柱液；e)紐莫康定B。的過(guò)柱液 濃縮至干，在多相溶劑體系下結(jié)晶，得到紐莫康定B。。該方法雖對(duì)C。雜質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)和純 度控制，但它的回收率較低，而且采用薄層色譜監(jiān)測(cè)，操作復(fù)雜，不利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。
[0005] 中國(guó)發(fā)明專利201410711185. 7公開(kāi)了一種采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱制備高純度紐 莫康定B。的方法，包括以下步驟：a)將含有紐莫康定的發(fā)酵液做酸沉、離心、脫色預(yù)處理，得 紐莫康定粗品；b)采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱裝填硅膠填料；c)將步驟a)所得的紐莫康定粗品 濃縮干燥后，加入氯仿/甲醇混合物溶解，上樣，氯仿/甲醇/水混合液洗脫，紫外檢測(cè)峰值 最大時(shí)收集洗脫液，得目標(biāo)組分，濃縮干燥即得紐莫康定B。。該方法雖采用了動(dòng)態(tài)軸向壓縮 柱來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的硅膠柱，但過(guò)程中的固液分離仍采用傳統(tǒng)離心和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，分離過(guò)程效率 低，能耗高，損失大。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)在制備過(guò)程中大多采用離心或蒸發(fā)的方式進(jìn)行分離和濃縮，采用吸附樹(shù) 脂或活性炭來(lái)除雜純化，工藝效率低，回收率低，能耗高。且過(guò)程中多采用毒性較大物質(zhì)，對(duì) 環(huán)境的控制難度大。因此降低過(guò)程能耗，提高工藝效率，提高回收率，以及更加環(huán)保的試劑 對(duì)紐莫康定B。的工業(yè)化生產(chǎn)有著很重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的技術(shù)目的在于從含發(fā)酵菌體中的發(fā)酵液體系中分離獲得紐莫康定B。，為 了達(dá)到本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種分離獲取紐莫康定B0的方法，其中，分離的具體步驟為： a. 采用管式膜過(guò)濾含有紐莫康定B。的發(fā)酵液，得菌體和過(guò)濾液 b. 用乙醇對(duì)菌體進(jìn)行浸提，固液分離獲得浸提液，用管式膜濃縮浸提液獲得濃縮液a; c. 用管式膜將過(guò)濾液濃縮脫水得濃縮液b; d. 混合濃縮液a和濃縮液b，控制乙醇質(zhì)量濃度為5%~30% ; e. 調(diào)混合液的pH至3~6,得懸濁液；用管式膜過(guò)濾懸濁液，截留獲得固體； f. 將固體用乙腈溶解，調(diào)節(jié)pH為5~8,在溶液中加入硅膠后，將乙腈蒸干，取固體裝柱， 并用乙酸乙酯和甲醇的混合液對(duì)硅膠柱進(jìn)行梯度洗脫至流出液中沒(méi)有紐莫康定B0,收集洗 脫液； g. 對(duì)洗脫液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮后，結(jié)晶得到紐莫康定B。； 本發(fā)明所述的方法，所述的步驟b中每千克濕菌體中加入乙醇的體積為2~3L，浸提次 數(shù)為1~3次，濃縮液a的體積為濃縮前體積的2~10%。在本步驟中，乙醇加入的目的為提取 菌體中的產(chǎn)品。
[0008] 優(yōu)選的，在膜分離后的菌體進(jìn)行洗滌。
[0009] 本發(fā)明所述的方法，所述的步驟e中pH值為3~4。
[0010] 本發(fā)明所述的方法，所述步驟f?中pH為6. 5~8. 0 ;所述硅膠目數(shù)為100~200,樣品 與溶解硅膠的質(zhì)量比值為1~2 :1。
[0011] 本發(fā)明所述的方法，步驟f中洗脫液中乙酸乙酯：甲醇的質(zhì)量配比為7~15 :1。
[0012] 本發(fā)明所述的方法，所述步驟a)中管式膜的膜孔徑為0. 03~0. 5Wn，優(yōu)選 0? 05~0. 2Mm;運(yùn)行壓力為 0?l~lMPa，優(yōu)選 0? 2~0. 8MPa。
[0013] 本發(fā)明所述的方法，所述步驟b)中管式膜的截留分子量為100~1500,優(yōu)選為 500~1000 ;運(yùn)行壓力為 1. 0~3.OMPa，優(yōu)選 1. 5~2. 5MPa。
[0014] 本發(fā)明所述的方法，所述步驟c)中管式膜的截留分子量為300~3000,優(yōu)選為 500~2000 ;運(yùn)行壓力為0. 5~1. 5MPa，優(yōu)選0. 8~1. 5Mpa;濃縮體積為原體積的5%~30%。
[0015] 本發(fā)明所述的方法，所述步驟e)中管式膜的膜孔徑為0. 01~0.lum，優(yōu)選 0? 02~0. 5um，運(yùn)行壓力為 0? 2~1.OMPa，優(yōu)選 0? 2~0. 8MPa。
[0016] 本發(fā)明所述的方法，所述步驟g中的結(jié)晶溶解溫度為40~50°C，析晶溫度為0~4°C。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于： a) 采用管式膜取代離心機(jī)，連續(xù)操作性好，分離效率高； b) 膜濃縮醇提液，可以有效去除小分子雜質(zhì)。且乙醇的回收率高，過(guò)程的能耗低，縮減 了生產(chǎn)成本。
[0018] c)采用乙酸乙酯和甲醇混合液梯度過(guò)硅膠柱，得到了高純度的過(guò)柱液，而且乙酸 乙酯和甲醇是后續(xù)結(jié)晶體系的有機(jī)相，方便了后面的結(jié)晶過(guò)程，節(jié)約了成本。
[0019] d)制備過(guò)程中采用的都是毒性小或無(wú)毒的溶劑，環(huán)境控制的難度較低。
[0020] e)將發(fā)酵菌體與發(fā)酵液分離后分開(kāi)提取產(chǎn)品，由于菌體與發(fā)酵液的物性差異，使 得提取過(guò)程中更加有針對(duì)性與效率，提高產(chǎn)品的純度與收率。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。所列的實(shí)施例僅作闡示之用，并表明本 發(fā)明的精神和范圍并非限于此中的細(xì)節(jié)及其修改案。
[0022] 實(shí)施例1 取紐莫康定B0的發(fā)酵液50L，在運(yùn)行壓力為0. 5MPa下，用膜孔徑0. 2iim的管式膜過(guò)濾 發(fā)酵液。得菌體21kg，過(guò)濾液23L。
[0023] 向菌絲體中加入25L乙醇浸提，充分?jǐn)嚢?0分鐘后過(guò)濾得乙醇浸提液26L。用25L 乙醇第二次對(duì)菌體進(jìn)行浸提，過(guò)濾后共得浸提液52L。
[0024] 在運(yùn)行壓力為2. 5MPa下，用截留分子量600的管式膜濃縮浸提液得濃縮液a2L。 在運(yùn)行壓力為2.OMPa下，用截留分子量2000的管式膜濃縮過(guò)濾液得濃縮液b8L。
[0025] 混合濃縮液a和濃縮液b，調(diào)pH4. 0,攪拌幾分鐘后，有大量析出物，得懸濁液。自 由沉降幾分鐘后，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)液體中無(wú)紐莫康定B0檢出。
[0026] 在運(yùn)行壓力為0. 4MPa下，用膜孔徑0. 05Wii的管式膜過(guò)濾上述懸濁液。得粗品210 g°
[0027] 用1. 5L乙腈將固體完全溶解，調(diào)pH6. 5。向其中加入300g硅膠，攪拌30分鐘。在 40°C，真空度-0. 05MPa的條件下蒸干，得到吸附了樣品的干硅膠粉。
[0028] 采用濕法裝柱，用乙酸乙酯逐漸將柱子（120mm*700mm)裝實(shí)后加入樣品。用 7~15 :1 (乙酸乙酯：甲醇)混合液梯度洗脫硅膠柱，經(jīng)HPLC檢測(cè)有紐莫康定B0檢出，5倍柱 體積洗脫后，流出液中沒(méi)有紐莫康定B0,得洗脫液20L。
[0029] 將上述洗脫液蒸發(fā)濃縮至2L，加入200ml水混合濃縮液。放置于4°C冰箱中結(jié)晶 2小時(shí)，析晶，離心，得固體潮晶；將潮晶放到冷凍干燥機(jī)中干燥，得成品58g。
[0030] 制得的成品經(jīng)HPLC檢測(cè)C0純度為0. 2%，紐莫康定B0的正相純度為99. 8%，反相 純度為98. 6%。
[0031] HPLC高效液相檢測(cè)方法為： ① 反相檢測(cè)條件： 測(cè)定柱：C18柱，4. 6mmX250mmX5um，柱溫：35°C;采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，B相 為0. 3%磷酸水溶液；流速為lmL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm;進(jìn)樣量：10ML。
[0032] 梯度洗脫表為： ② 正相檢測(cè)條件：
測(cè)定?。篠i02柱，4. 6_X250_X5um;柱溫35°C;流動(dòng)相A為乙酸乙酯（84%)，流動(dòng)相B為甲醇（9%)，流動(dòng)相C為水（7%);流速為lmL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)278nm;進(jìn)樣量20ML。運(yùn)行時(shí) 間 30min。
[0033] 實(shí)施例2: 取紐莫康定BO的發(fā)酵液50L，在運(yùn)行壓力為0. 5MPa下，用膜孔徑0. 3um的管式膜過(guò)濾 發(fā)酵液。得菌體20kg，過(guò)濾液24L。
[0034] 向菌絲體中加入30L乙醇浸提，充分?jǐn)嚢?0分鐘后過(guò)濾得乙醇浸提液32L。用30L 乙醇第二次對(duì)菌體進(jìn)行浸提，過(guò)濾后共得浸提液64L。
[0035] 在運(yùn)行壓力為2. 5MPa下，用截留分子量600的管式膜濃縮過(guò)濾液得濃縮液a2L。 在運(yùn)行壓力為2.OMPa下，用截留分子量3000的管式膜濃縮過(guò)濾液得濃縮液b10L。
[0036] 混合濃縮液a和濃縮液b，調(diào)pH3. 5,攪拌幾分鐘后，有大量析出物，得懸濁液。自 由沉降幾分鐘后，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)液體中無(wú)紐莫康定B0檢出。