一種用于體內(nèi)外凋亡成像探針的多肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽及其用途，尤其涉及一種用于 體內(nèi)外凋亡成像探針的多肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞凋亡是最常見的一種細(xì)胞程序性死亡的方式，不僅在生長發(fā)育等生理過程中 發(fā)揮著重要作用，同時更與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展以及治療過程息息相關(guān)。比如，心臟中心 肌細(xì)胞的過度凋亡是心力衰竭等心血管疾病的重要誘因；而組織中過少的細(xì)胞凋亡也可能 導(dǎo)致增生性疾病、癌癥等的發(fā)生。更值得注意的是，目前已有研究表明，在癌癥治療過程中， 化療和放療會引起腫瘤組織中細(xì)胞凋亡的明顯增加，這種由治療誘導(dǎo)的凋亡可以作為評價 腫瘤治療效果的一個重要指標(biāo)。因此凋亡探針的研發(fā)及其在細(xì)胞凋亡成像中的應(yīng)用研究將 為腫瘤等疾病的研究和治療提供重要的新技術(shù)和新方法。
[0003]目前體外應(yīng)用最為廣泛的凋亡探針主要有兩大類：（1)針對在凋亡期間從細(xì)胞膜 內(nèi)側(cè)翻至外側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS)的膜聯(lián)蛋白（annexinV) ; (2)在凋亡過程中高度活化 的半胱天冬酶（caspase)激酶家族為靶標(biāo)的抗體。對于體內(nèi)成像研究，目前主要集中在對 已有的體外探針進(jìn)行修飾，比如采用放射性元素修飾膜聯(lián)蛋白（annexinV)，以此作為顯影 劑，可在單光子發(fā)射計算機斷層成像（SPECT)或正電子發(fā)射計算機斷層成像（PET)上對體 內(nèi)凋亡進(jìn)行成像。然而由于這類大分子蛋白類物質(zhì)在體內(nèi)清除速率較慢，從而造成信噪比 較低，難以應(yīng)用到臨床。除了上述兩種探針之外，其他類別的探針極少有文獻(xiàn)報道。
[0004] 熱休克蛋白60(HSP60)是一種主要存在于線粒體內(nèi)的分子伴侶。曹智等研究了熱 休克蛋白60的抗細(xì)胞凋亡與促細(xì)胞凋亡作用，其提出：線粒體HSP60發(fā)揮抗凋亡作用主要 有兩條途徑：1)直接影響線粒體內(nèi)的凋亡相關(guān)因子，抑制線粒體凋亡通路的激活：2)保護(hù) 線粒體呼吸鏈的完整性，減少氧自由基產(chǎn)生，間接抑制凋亡。胞漿中的HSP60可通過影響凋 亡相關(guān)因子而抑制凋亡（參見曹智等，"熱休克蛋白60的抗細(xì)胞凋亡與促細(xì)胞凋亡作用"， 節(jié)能環(huán)保和諧發(fā)展-2007中國科協(xié)年會論文集（二），2007年9月1日）。因此HSP60是細(xì) 胞凋亡成像的潛在靶點。
[0005] 由于多肽易于合成，在人體內(nèi)易于代謝并且不會帶來毒副作用和嚴(yán)重的免疫反 應(yīng)，目前已有一些文獻(xiàn)報道了將多肽用于靶向凋亡細(xì)胞，例如CN102177174A公開了一種以 特異方式靶向正在凋亡的凋亡細(xì)胞的肽，其可以有效靶向腫瘤、心肌梗塞、中風(fēng)及動脈硬化 組織里發(fā)生的凋亡，可與影像物質(zhì)結(jié)合而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡成像。CN102014970A公開了 將99mTc標(biāo)記的含19個氨基酸的多肽作為磷脂酰乙醇胺結(jié)合分子探針用于檢測細(xì)胞凋亡 /壞死。CN101965356A公開了一種以特異方式與磷脂酰絲氨酸結(jié)合的多肽，該多肽與磷脂 酰絲氨酸的組成物可作為有效成分用于檢測凋亡細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞以及成像。然而，由于磷 脂酰絲氨酸也會表達(dá)在正常細(xì)胞上，比如活化的B細(xì)胞或T細(xì)胞，因此針對該靶點的多肽應(yīng) 用于體內(nèi)時容易造成假陽性。同時采用放射性核素標(biāo)記進(jìn)行顯影，不僅合成成本相對較高， 而且由于放射污染，對實驗環(huán)境也有嚴(yán)格的限制，不利于科學(xué)研究和臨床推廣。
[0006] 從目前的研究來看，并未發(fā)現(xiàn)能夠特異性結(jié)合到凋亡細(xì)胞中熱休克蛋白 60(HSP60)上的多肽，因此，研發(fā)一種新型體外、體內(nèi)凋亡成像的多肽類探針，為腫瘤等疾病 的研究和治療提供可能的新技術(shù)和新方法，是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種多肽及其用途，特別提供了一種用于 體內(nèi)外凋亡成像探針的多肽及其在體外細(xì)胞凋亡成像或者體內(nèi)凋亡染色方面的用途。該多 肽類探針在人體中易于清除，為腫瘤等疾病的研究和治療提供了重要的新技術(shù)和新方法。
[0008] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 第一方面，本發(fā)明提供了一種用于體內(nèi)外凋亡成像探針的多肽，所述多肽具有如 SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。
[0010] SEQIDN0 :1具有如下氨基酸序列：
[0011] ⑶QNLQGPMLQGDPGFQRCIDGNVRLVFLFRG(P17)
[0012] 本發(fā)明的多肽可通過人工化學(xué)合成制得。
[0013] 本發(fā)明的多肽能夠特異性地與凋亡細(xì)胞結(jié)合。
[0014] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述多肽可以特異性地結(jié)合到凋亡細(xì)胞胞漿內(nèi)的 HSP60蛋白上。由于在細(xì)胞凋亡過程中，HSP60在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量大，使得結(jié)合該靶點的多肽 在凋亡細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合量極高，相比于已有探針，應(yīng)用該多肽更容易區(qū)分凋亡細(xì)胞和正常細(xì) 胞。
[0015] 本發(fā)明的多肽對誘導(dǎo)凋亡后的細(xì)胞具有顯著結(jié)合能力，而在正常生長的細(xì)胞上結(jié) 合極少。所述多肽對誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的結(jié)合能力通過多肽探針在細(xì)胞模型上的凋亡成像和流 式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強度方法進(jìn)行檢測。
[0016] 本發(fā)明的多肽隨著細(xì)胞凋亡程度增加，結(jié)合量逐漸增加，呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。隨著 細(xì)胞凋亡程度增加，所述多肽的結(jié)合量逐漸增加，呈現(xiàn)出線性關(guān)系。
[0017] 本發(fā)明所述細(xì)胞包括但不限于：體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞，優(yōu)選為白血病細(xì) 胞。
[0018] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述體細(xì)胞為心肌母細(xì)胞。
[0019] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述腫瘤細(xì)胞為宮頸癌細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞。
[0020] 第二方面，本發(fā)明還提供了一種DNA片段，其包含編碼如本發(fā)明第一方面所述的 多肽的核苷酸序列。
[0021] 第三方面，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有至少一個拷貝的如 本發(fā)明第二方面所述的DNA片段。
[0022] 第四方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測凋亡細(xì)胞的組合物，其包含如本發(fā)明第 一方面所述的多肽。
[0023] 第五方面，本發(fā)明還提供了一種用于成像患腫瘤病癥部位的組合物，其包含如本 發(fā)明第一方面所述的多肽。
[0024] 第六方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的多肽在制備體外細(xì)胞凋亡 成像或體內(nèi)凋亡染色用制劑中的用途。
[0025] 第七方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的多肽在制備用于治療、預(yù) 防或診斷腫瘤或白血病的藥物或成像制劑中的用途。
[0026] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述腫瘤為宮頸癌或乳腺癌。
[0027] 本發(fā)明的多肽在成瘤小鼠注射抗癌藥物治療后，可以在腫瘤內(nèi)部聚集。
[0028] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述腫瘤為乳腺癌。
[0029] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述抗癌藥物為環(huán)磷酰胺。
[0030] 本發(fā)明的多肽能夠結(jié)合在腫瘤組織中的凋亡區(qū)域，并且可以進(jìn)行體內(nèi)凋亡染色。
[0031] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述腫瘤為乳腺癌。
[0032] 本發(fā)明的多肽能夠用于評價腫瘤或白血病的治療效果。
[0033] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述腫瘤為宮頸癌和乳腺癌。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0035] 本發(fā)明所述的多肽可以高效地結(jié)合到凋亡細(xì)胞上，其在凋亡細(xì)胞上的結(jié)合強度比 正常細(xì)胞高出10倍以上，通過熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法均能將凋亡細(xì)胞 與正常細(xì)胞明顯區(qū)分出來。該多肽特異性地結(jié)合到凋亡細(xì)胞胞漿內(nèi)的HSP60蛋白上，其對 誘導(dǎo)凋亡后的細(xì)胞具有顯著結(jié)合能力，在體內(nèi)能夠結(jié)合在腫瘤組織中的凋亡區(qū)域，并且可 以進(jìn)行體內(nèi)凋亡染色，在人體中易于清除，為評價腫瘤或白血病治療效果提供了可行的方 法和技術(shù)。
【附圖說明】
[0036] 圖1為P17多肽探針體外細(xì)胞凋亡成像結(jié)果圖；
[0037] 其中，圖1A-1B為P17多肽探針在Jurkat細(xì)胞模型上的凋亡成像結(jié)果圖；圖1C-1D 為P17多肽探