一種硒酸酯化梭柄松苞菇多糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多糖的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種硒酸酯化梭柄松苞菇多糖（sCVPs) 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或 其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時(shí)長(zhǎng)期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、 腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。根據(jù)世界衛(wèi)生組織在2014年公布的數(shù)據(jù)，全球 糖尿病患者人數(shù)已經(jīng)達(dá)到3. 47億。
[0003] 具有藥用價(jià)值的食用真菌在傳統(tǒng)民間藥物中被認(rèn)為是非常重要的治療藥物之一， 并且應(yīng)用非常普遍。研究表明，食用真菌對(duì)疾病的治療主要是由于它所含有生物活性物質(zhì) 所引起的。這些食用真菌的活性物質(zhì)可以使糖尿病患者的肝臟、胰腺等臟器功能恢復(fù)正常， 從而促進(jìn)胰島素和相關(guān)激素的分泌，使得機(jī)體的代謝功能恢復(fù)。
[0004] 多糖具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等藥用活性。大量研究證明，將多糖硒酸 酯化之后能夠顯著增加多糖的生物活性，并且糖尿病患者體內(nèi)硒含量普遍低于正常人，因 此合理補(bǔ)充硒元素有利于緩解糖尿病患者的相關(guān)癥狀，同時(shí)可以對(duì)糖尿病進(jìn)行有效預(yù)防。 現(xiàn)階段對(duì)多糖進(jìn)行硒化修飾的方法主要是化學(xué)法和生物法，生物法存在這產(chǎn)品質(zhì)量不均 一，重復(fù)性差，培養(yǎng)條件控制困難等缺點(diǎn)；化學(xué)法往往為了獲得較高硒含量，而以損失富硒 多糖的得率為代價(jià)，并且硒轉(zhuǎn)化率也相對(duì)較低。目前并沒(méi)有利用梭柄松苞菇多糖進(jìn)行硒酸 酯化的研究，值得注意的是梭柄松苞菇多糖的分子量較其他菌類多糖而言較小，而分子量 的大小往往與取代度和生物活性成反比，因此用硒酸酯化的梭柄松苞菇多糖應(yīng)用于抗糖尿 病的研究必將會(huì)為多糖的化學(xué)修飾和多糖的生物活性提供新思路和參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種以梭柄松苞菇為代表的高效的食用菌多糖硒酸酯化 的方法，，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問(wèn)題。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種硒酸酯化梭柄松苞菇多糖的制 備方法，其特征在于：（1)取新鮮梭柄松苞菇進(jìn)行預(yù)處理；（2)梭柄松苞菇多糖的制備，具 體為：水提?。合扔靡掖歼M(jìn)行洗滌，然后離心處理，將離心管的沉淀樣品干燥，并按料液比 1 : 20與蒸餾水混合，然后進(jìn)行超聲波處理，超聲波作用功率為150W，每工作15min，暫停 5min，提取溫度80°C，提取時(shí)間2. 5h，上述水提取步驟重復(fù)提取三次，合并提取液即為梭柄 松苞菇多糖提取液；乙醇沉淀：將梭柄松苞菇多糖提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，加入5倍體積 的95 %乙醇溶液，攪拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再離心處理，然后棄上清液，收集沉淀，凍 干待用；去除蛋白質(zhì)：按固液比1 : 10加入蒸餾水溶解梭柄松苞菇多糖，然后加入1/4倍體 積的氯仿-正丁醇，充分振蕩30min后，再離心處理，獲得三層液體，吸取最下層多糖溶液， 重復(fù)該去除蛋白質(zhì)步驟5次；去除小分子物質(zhì)：將去除蛋白質(zhì)的多糖提物，流水透析過(guò)夜， 透析袋的截留分子量為3000,以去除小分子雜質(zhì)；再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將該多糖提取液濃縮， 與4倍體積的95%乙醇溶液混合，攪拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再離心處理，離心機(jī)轉(zhuǎn) 速5000rpm，時(shí)間5min，棄上清液，沉淀即為梭柄松苞菇多糖，冷凍干燥備用；（3)硒酸酯化 梭柄松苞菇多糖的制備，具體為：取分子量范圍為5. 0X103-1. 0X104Da的500mg梭柄松苞 菇多糖置于三口燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為〇. 5%的HN03水溶液100mL，加熱、攪拌使梭柄松 苞菇多糖全部溶解，水浴升溫至70°C時(shí)，分別加入400mgNa2SeO#P1. 44gBaCl2，反應(yīng)10h; 反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻至室溫，用無(wú)水Na2C03調(diào)整pH值至6,再加入無(wú)水Na2S04以沉淀多余 的BaCl2，離心去沉淀，透析，取少量透析液加入維生素C檢測(cè)，無(wú)紅色時(shí)停止透析，冷凍干燥 后所得粉末即為硒酸酯化梭柄松苞菇多糖。
[0007] 進(jìn)一步的，新鮮梭柄松苞菇的預(yù)處理步驟具體為，
[0008] 清潔：用塑料刮片將新鮮梭柄松苞菇表面的泥漬去除，不可用水清洗，不然表面的 多糖會(huì)損失；
[0009] 切塊：將清潔后的新鮮梭柄松苞菇切塊，每一個(gè)切塊大小適中且均勻；
[0010] 冷凍干燥：將梭柄松荀燕塊放入冷凍干燥機(jī)，獲得含水量低于5%的樣品。
[0011] 進(jìn)一步的，乙醇沉淀步驟和去除蛋白質(zhì)步驟中的離心處理的離心機(jī)轉(zhuǎn)速5000rpm， 時(shí)間5min。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：（1)本專利選用的原料（梭柄松苞菇）在 四川、云南和貴州等地廣泛種植，采集方便，價(jià)格低廉，并且CVPs已經(jīng)被證明具有較為突出 的抗糖尿病活性，因此具備進(jìn)一步被開(kāi)發(fā)利用的潛質(zhì)；（2)本專利建立了一種高效的sCVPs 的制備方法，其中首次評(píng)價(jià)了多糖分子量范圍對(duì)多糖硒酸酯化的影響，最終所得sCVPs的 硒含量、硒轉(zhuǎn)化率和得率分別達(dá)到了 174. 22yg/mg、29. 31 %和61. 43%。并且整個(gè)制備過(guò) 程的反應(yīng)條件溫和，成本低廉，操作簡(jiǎn)單易于工業(yè)推廣；(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)CVPs進(jìn)行硒 酸酯化修飾后，sCVPs的生物活性得到顯著提高，僅需攝入0. 2g/kg/d劑量的sCVPs，便能夠 顯著提高糖尿病小鼠血清中各氧化劑的水平，以緩解其氧化應(yīng)激水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病 的治療。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例 僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0014] 本發(fā)明提供一種硒酸酯化梭柄松苞菇多糖的制備方法，其特征在于：（1)取新鮮 梭柄松苞菇進(jìn)行預(yù)處理；清潔：用塑料刮片將新鮮梭柄松苞菇表面的泥漬去除，不可用水 清洗，不然表面的多糖會(huì)損失；切塊：將清潔后的新鮮梭柄松苞菇切塊，每一個(gè)切塊大小適 中且均勾；冷凍干燥：將梭柄松荀燕塊放入冷凍干燥機(jī)，獲得含水量低于5%的樣品。（2) 梭柄松苞菇多糖的制備，具體為：水提?。合扔靡掖歼M(jìn)行洗滌，然后離心處理，將離心管的 沉淀樣品干燥，并按料液比1 : 20與蒸餾水混合，然后進(jìn)行超聲波處理，超聲波作用功率 為150W，每工作15min，暫停5min，提取溫度80°C，提取時(shí)間2. 5h，上述水提取步驟重復(fù)提 取三次，合并提取液即為梭柄松苞菇多糖提取液；乙醇沉淀：將梭柄松苞菇多糖提取液用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，加入5倍體積的95%乙醇溶液，攪拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再離心 處理，然后棄上清液，收集沉淀，凍干待用；去除蛋白質(zhì)：按固液比1 : 10加入蒸餾水溶解 梭柄松苞菇多糖，然后加入1/4倍體積的氯仿-正丁醇，充分振蕩30min后，再離心處理， 獲得三層液體，吸取最下層多糖溶液，重復(fù)該去除蛋白質(zhì)步驟5次；去除小分子物質(zhì)：將去 除蛋白質(zhì)的多糖提物，流水透析過(guò)夜，透析袋的截留分子量為3000,以去除小分子雜質(zhì)；再 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將該多糖提取液濃縮，與4倍體積的95%乙醇溶液混合，攪拌0. 5h后，置 于4°C冰箱12h，再離心處理，離心機(jī)轉(zhuǎn)速5000rpm，時(shí)間5min，棄上清液，沉淀即為梭柄松 苞菇多糖，冷凍干燥備用；（3)硒酸酯化梭柄松苞菇多糖的制備，具體為：取分子量范圍為 5.OX103-1.OX104Da的500mg梭柄松苞菇多糖置于三口燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的 HN03水溶液100mL，加熱、攪拌使梭柄松苞菇多糖全部溶解，水浴升溫至70°C時(shí)，分別加入 400mgNa2Se0jP1. 44gBaCl2，反應(yīng)10h;反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻至室溫，用無(wú)水Na2C03調(diào)整 pH值至6,再加入無(wú)水Na2S04以沉淀多余的BaCl2，離心去沉淀，透析，取少量透析液加入維 生素C檢測(cè)，無(wú)紅色時(shí)停止透析，冷凍干燥后所得粉末即為硒酸酯化梭柄松苞菇多糖。
[0015] 上述最優(yōu)梭柄松苞菇多糖分子量范圍為5. 0X103-1. 0X104Da，其確定采用如下方 法，
[0016] (1)多糖酸水解：①取適量梭柄松苞菇多糖樣品于具塞試管中，用0.lmol/L三氟 乙酸（TFA)溶解，然后在110°C條件下水解lh，再用分子截留規(guī)格為5.0X102的透析袋對(duì) 該反應(yīng)液進(jìn)行透析，以去除三氟乙酸和其他雜質(zhì)，并收集透析袋內(nèi)液體，即為多糖水解液； ②除分子截留規(guī)格為1.0X106的透析袋直接對(duì)多糖水解進(jìn)行透析外，其余規(guī)格的透析袋 均對(duì)上一次透析袋外的多糖水解液進(jìn)行透析（透析袋規(guī)格：1.OX106、5.OX105、3.OX105、 1. 0X105、5. 0X104、3. 0X104、1. 0X104、5. 0X103、3. 0X103、1. 0X103)，收集透析袋內(nèi)的液 體，凍干后即獲得多糖分子量分別為：> 1. 〇X106、5. 0X105-1. 0X106、3. 0X105-5. 0X105、 1.OX105-3.OX105、5.OX104-1.OX105、3.OX104-5.OX104、1.OX104-3.OX104、 5.OX103-1.OX104、3.OX103-5.OX103、1.OX103-3.OX103,10 組不同分子量范圍的組分。
[0017] (2)每個(gè)組分進(jìn)行硒酸酯化比較它們的取代度和得率。
[0018] 表1:分子量對(duì)多糖的硒酸酯化取代度和得率的影響
[0019]
[0020] 每個(gè)數(shù)值均表示為三次測(cè)試的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（SD)，同一列中不同的字母表示 具有顯著差異（P< 〇? 05)
[0021] 由表1可得，多糖的分子量為5. 0X 103-1. 0X 104、3. 0X 103-5. 0X 103、 1. OX 103-3. O