沃格瑪木霉產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地，涉及沃格瑪木霉產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基及其制備 方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 木霉屬（Trichoderma)真菌種類很多，分布廣泛，是一類重要的生物資源，部分種 類在許多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，具有良好的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景，因而備受關(guān)注。
[0003] 2005年，沃格瑪木霉（Trichodermavoglmayrii)首次報道于奧地利，2014年本專 利申請的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)該種在中國分布，并篩選證明了沃格瑪木霉P-T8196菌株對多 種植物病原真菌（以下簡稱植病菌）均具有一定的生防潛力。但是，該菌株在PDA、CMD、SNA 等多種培養(yǎng)基上生長緩慢，菌落稀疏，缺乏氣生菌絲，產(chǎn)孢所需時間長，量少，嚴重影響和阻 礙該菌株生防潛能的發(fā)揮和進一步利用。國內(nèi)外鮮有對該菌人工培養(yǎng)條件的研究報道，適 宜該菌生長的培養(yǎng)條件不清楚，因此明確適宜沃格瑪木霉生長的培養(yǎng)條件，將為后續(xù)生理 學(xué)、化學(xué)和菌株利用等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了沃格瑪木霉培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用，解決了沃格瑪木霉在其他 培養(yǎng)基中生長緩慢、氣生菌絲少、產(chǎn)孢少且時間長的問題。
[0005] 本發(fā)明的一個方面，提供一種沃格瑪木霉產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基，具體成分及含量如下： 糊精20 - 60g，蛋白胨10 - 30g，酵母粉1 - 5g，硫酸鎂0. 5 - 4. 5g，磷酸二氫鉀0. 6 -lg，水 1000mL，pH自然。
[0006] 本發(fā)明的另一個方面，提供以上所述培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：
[0007] 將糊精、蛋白胨和酵母粉按照所需終濃度配制溶液；
[0008] 將硫酸鎂和磷酸二氫鉀配制成母液；
[0009] 對上述成分進行滅菌，其中，糊精、蛋白胨和酵母粉配制的溶液采用高壓蒸汽滅 菌，硫酸鎂和磷酸二氫鉀采用過濾滅菌；
[0010] 按照所需終濃度定量，混配均勻。
[0011] 本發(fā)明的再一個方面，提供一種促進沃格瑪木霉產(chǎn)菌絲的培養(yǎng)方法，包括如下步 驟：
[0012] 將沃格瑪木霉接種于PDA培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)；
[0013] 然后取活化培養(yǎng)后的沃格瑪木霉菌塊，接種于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備接種液；
[0014] 按1X107/mL孢子的接種量，將沃格瑪木霉的接種液接種于以上所述的本發(fā)明的 培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速160rpm，溫度28°C，黑暗條件下培養(yǎng)，6 - 7天達到發(fā)酵終點。
[0015] 以上所述的培養(yǎng)方法中，活化培養(yǎng)條件為25°C培養(yǎng)3天。
[0016] 以上所述的培養(yǎng)方法中，接種液的制備條件為在轉(zhuǎn)速160rpm，溫度28°C，黑暗條 件下培養(yǎng)5天。
[0017] 本發(fā)明提供的培養(yǎng)基組成成分明確，簡單，易配制，成本較低，利用該培養(yǎng)基發(fā)酵 生產(chǎn)沃格瑪木霉菌具有工藝簡單，菌體生長速度快，菌絲產(chǎn)量高等優(yōu)點，同時該培養(yǎng)基中的 碳氮源均未引入農(nóng)副產(chǎn)品，使代謝產(chǎn)物更容易分離提取，既適于該菌的理論研究，也適于工 業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0018] 以下實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行更加詳細的說明，以便能夠更好地理解 本發(fā)明的方案以及其各個方面的優(yōu)點。然而，以下描述的【具體實施方式】和實施例僅是說明 的目的，而不是對本發(fā)明的限制。
[0019] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0020] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021] 實施例1利用產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)沃格瑪木霉菌絲體
[0022] 沃格瑪木霉產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基配方為：糊精50g，蛋白胨21g，酵母粉2. 9g，硫酸鎂 2. 3g，磷酸二氫鉀0. 9g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0023] 對照培養(yǎng)基 1(GaoHJ，ChuX，WangYW,ZhouF,ZhaoK，MuZM,LiuQX. 2013. MediaoptimizationforlaccaseproductionbyTrichodermaharzianumZF-2using responsesurfacemethodology.J.Microbiol.Biotechnol. 23:1757 - 1764.):葡萄糖 20g，硫酸銨lg，磷酸二氫鉀0. 6g，硫酸鎂lg，加水定容至1000mL，pH自然。
[0024] 對照培養(yǎng)基2 :土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0025] 將沃格瑪木霉菌株（Trichodermavoglmayrii)P_T8196 (本專利申請的發(fā)明人分 離并已于2015年8月24日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 11207。保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。）接種于馬鈴薯葡萄糖固體 培養(yǎng)基（PDA)上活化，25°C培養(yǎng)3天，然后用打孔器在菌落邊緣取直徑為5_的菌塊8個， 接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB)中，裝液量100mL(250mL三角瓶），置于轉(zhuǎn)速160rpm，溫 度28°C，黑暗條件下培養(yǎng)5天，制備接種液。
[0026] 按照1X107/mL孢子的接種量，將沃格瑪木霉接種于上述3種培養(yǎng)基中，裝液量 100mL(250mL三角瓶），置于轉(zhuǎn)速160rpm，溫度28°C，黑暗條件下培養(yǎng)，6天后，用直徑為 12. 5cm的中速定性濾紙（已烘干稱重）過濾發(fā)酵產(chǎn)物，并用100mL蒸餾水洗滌3次，然后將 過濾完畢的濾紙及菌絲體置于80°C培養(yǎng)箱內(nèi)烘干至菌體恒重。結(jié)果顯示，本發(fā)明培養(yǎng)基、對 照培養(yǎng)基1、對照培養(yǎng)基2培養(yǎng)的菌絲體產(chǎn)量分別為26. 9g/L、7. 08g/L、2. 45g/L，差異顯著。 本發(fā)明培養(yǎng)基的菌絲產(chǎn)量明顯高于對照培養(yǎng)基1和對照培養(yǎng)基2的菌絲產(chǎn)量。
[0027] 產(chǎn)物驗證：采用CTAB法對發(fā)酵所得的沃格瑪木霉菌絲體進行基因組DNA提取，對 其ITS(核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）進行PCR擴增（所用引物為ITS4和ITS5組成的引物對）并 測序，將測序結(jié)果提交GenBank進行Blast分析。引物序列如下：
[0028] ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'
[0029] ITS5 :5, -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3，
[0030]測序結(jié)果詳見序列表的序列1(SEQIDN0 :1)，分析發(fā)現(xiàn)其與GenBank中 Trichodermavoglmayrii(沃格瑪木霉）的CPK948、CPK1592兩個菌株的同源性高達100%， 與CPK95UCPK941兩個菌株的同源性達99%，可確定利用本發(fā)明提供的產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基發(fā)酵 得到的產(chǎn)物為沃格瑪木霉的菌絲體。
[0031] 實施例2利用產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)沃格瑪木霉菌絲體
[0032] 沃格瑪木霉產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基配方為：糊精40g，蛋白胨20g，酵母粉3g，硫酸鎂lg，磷 酸二氫鉀〇. 8g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0033] 對照培養(yǎng)基1(Gaoetal. 2013):葡萄糖20g，硫酸銨lg，磷酸二氫鉀0? 6g，硫酸鎂 lg，加水定容至l〇〇〇mL，pH自然。
[0034] 對照培養(yǎng)基2 :土豆200g，葡萄糖20g，加水定容至1000mL，pH自然。
[0035] 將沃格瑪木霉菌株P(guān)-T8196 (本專利申請的發(fā)明人分離并保存）接種于馬鈴薯葡 萄糖固體培養(yǎng)基（PDA)上活化，25°C培養(yǎng)3天，然后用打孔器在菌落邊緣取直徑為5mm的 菌塊8個，接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB)中，裝液量100mL(250mL三角瓶），置于轉(zhuǎn)速 160rpm，溫度28°C，黑暗條件下培養(yǎng)5天，制備接種液。
[0036] 按照1X107/mL孢子的接種量，將沃格瑪木霉接種于上述3種培養(yǎng)基中，裝液量 100mL(250mL三角瓶），置于轉(zhuǎn)速160rpm，溫度28°C，黑暗條件下培養(yǎng)，6天后，用直徑為 12. 5cm的中速定性濾紙（已烘干稱重）過濾發(fā)酵產(chǎn)物，并用100mL蒸餾水洗滌3次，然后將 過濾完畢的濾紙及菌絲體置于80°C培養(yǎng)箱內(nèi)烘干至菌體恒重。結(jié)果顯示，本發(fā)明培養(yǎng)基、對 照培養(yǎng)基1、對照培養(yǎng)基2培養(yǎng)的菌絲體產(chǎn)量分別為26. 0g/L、7. 08g/L、2. 45g/L，差異顯著。 本發(fā)明培養(yǎng)基的菌絲產(chǎn)量明顯高于對照培養(yǎng)基1和對照培養(yǎng)基2的菌絲產(chǎn)量。
[0037] 采用CTAB法對發(fā)酵所得的沃格瑪木霉菌絲體進行基因組DNA提取，對其ITS(核 糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）進行PCR擴增（所用引物為ITS4和ITS5組成的引物對）