一種蘋(píng)果酸—乳酸細(xì)菌及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】一種蘋(píng)果酸一乳酸細(xì)菌及其應(yīng)用
[0001] -、技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蘋(píng)果酸一乳酸細(xì)菌及其應(yīng)用。
[0002] 二、【背景技術(shù)】： 蘋(píng)果酸一乳酸發(fā)酵（MLF)是干紅葡萄酒生產(chǎn)必不可少的工序之一，目前，干紅葡萄酒生 產(chǎn)中進(jìn)行蘋(píng)果酸一乳酸發(fā)酵通常有兩種方法，一是自然觸發(fā)，二是人工接種乳酸菌，但是迄 今國(guó)內(nèi)還不能生產(chǎn)活性乳酸菌于粉，此類(lèi)發(fā)酵劑全部依賴進(jìn)口。究其原因在于葡萄酒生產(chǎn) 要求特殊的環(huán)境，大多數(shù)能夠進(jìn)行蘋(píng)果酸一乳酸發(fā)酵的細(xì)菌很難在其中繁殖代謝。篩選出 適合中國(guó)葡萄酒生產(chǎn)的蘋(píng)果酸一乳酸細(xì)菌尤為迫切。
[0003] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明為了解決上述【背景技術(shù)】中的不足之處，提供一種蘋(píng)果酸一乳酸細(xì)菌及其應(yīng)用， 其篩選出對(duì)不良環(huán)境抗性強(qiáng)、蘋(píng)果酸-乳酸酶活力高、釀酒特性好的優(yōu)良蘋(píng)果酸一乳酸細(xì) 菌。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種蘋(píng)果酸一乳酸細(xì)菌，其特征在 于：所述的蘋(píng)果酸一乳酸細(xì)菌為酒酒球菌SD-lb，該菌株已于2014年4月2日保藏于中 國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為：CGMCCN0. 8988，。
[0005]所述的酒酒球菌SD-lb的培養(yǎng)方法為： 1) 在固體分離培養(yǎng)基中，在28-30°C和厭氧充氮?dú)鈼l件下培養(yǎng)5-8天，得分離菌株； 2) 對(duì)步驟1)分離獲得的菌株在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種擴(kuò)大，液體培養(yǎng)25-28°C，靜置， 在培養(yǎng)菌到對(duì)數(shù)期末時(shí)進(jìn)行離心收集菌體，離心轉(zhuǎn)速為lOOOrpm; 所述的固體分離培養(yǎng)基為改良ATB培養(yǎng)基或改良MRS培養(yǎng)基。
[0006] 所述的改良ATB培養(yǎng)基：ATB培養(yǎng)基+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬(wàn)占霉素。
[0007] 所述的改良MRS培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬(wàn) 古霉素。
[0008] 所述的ATB培養(yǎng)基的配方為：ATB培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄 糖l〇g，硫酸鎂〇? 2g，硫酸錳0? 05g，鹽酸半胱氨酸0? 5g，1MHCL或NaOH調(diào)pH至4. 8。
[0009] 所述的MRS培養(yǎng)基的配方為：MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/ L萬(wàn)古霉素。
[0010] 酒酒球菌SD-lb的分離方法為：在上述固體分離培養(yǎng)基即ATB培養(yǎng)基+ 50mg/L放 線菌酮+50mg/L萬(wàn)古霉素或MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬(wàn)古霉 素上，采用涂布分離法對(duì)蘋(píng)果酸-乳酸細(xì)菌進(jìn)行分離，取樣量為0.lml，培養(yǎng)溫度為28°C， 在厭氧箱中充N(xiāo)2培養(yǎng)5-7天，充N(xiāo)2的量應(yīng)大于厭氧箱內(nèi)剩余體積的95%。
[0011] -種酒酒球菌SD-lb在制備葡萄酒中的應(yīng)用。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下：本發(fā)明酒酒球菌SD-lb對(duì)葡萄酒環(huán) 境適應(yīng)性良好，可用于葡萄酒行業(yè)以及相關(guān)的食品行業(yè)。
[0013] 四、【附圖說(shuō)明】： 圖1為本發(fā)明微生物在干紅葡萄酒生產(chǎn)中的應(yīng)用步驟圖。
[0014] 五、【具體實(shí)施方式】： 一種蘋(píng)果酸一乳酸細(xì)菌，其特征在于：所述的蘋(píng)果酸一乳酸細(xì)菌為酒酒球菌SD-lb，該 菌株已于2014年4月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為：CGMCCN0. 8988 〇
[0015] 所述的酒酒球菌SD-lb的培養(yǎng)方法為： 1) 在固體分離培養(yǎng)基中，在28-30°C和厭氧充氮?dú)鈼l件下培養(yǎng)5-8天，得分離菌株； 2) 對(duì)步驟1)分離獲得的菌株在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種擴(kuò)大，液體培養(yǎng)25-28°C，靜置， 在培養(yǎng)菌到對(duì)數(shù)期末時(shí)進(jìn)行離心收集菌體，離心轉(zhuǎn)速為lOOOrpm; 所述的固體分離培養(yǎng)基為改良ATB培養(yǎng)基或改良MRS培養(yǎng)基。
[0016] 所述的改良ATB培養(yǎng)基：ATB培養(yǎng)基+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬(wàn)占霉素。
[0017] 所述的改良MRS培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬(wàn) 古霉素。
[0018] 所述的ATB培養(yǎng)基的配方為：ATB培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄 糖l〇g，硫酸鎂〇? 2g，硫酸錳0? 05g，鹽酸半胱氨酸0? 5g，1MHCL或NaOH調(diào)pH至4. 8。
[0019] 所述的MRS培養(yǎng)基的配方為：MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/ L萬(wàn)古霉素。
[0020] 酒酒球菌SD-lb的分離方法為：在上述分離培養(yǎng)基即ATB培養(yǎng)基+ 50mg/L放線 菌酮+50mg/L萬(wàn)古霉素或MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬(wàn)古霉素 上，采用涂布分離法對(duì)蘋(píng)果酸-乳酸細(xì)菌進(jìn)行分離，取樣量為0.lml，培養(yǎng)溫度為28°C，在 厭氧箱中充N(xiāo)2培養(yǎng)5-7天，充N(xiāo)2的量應(yīng)大于厭氧箱內(nèi)剩余體積的95%。
[0021] -種酒酒球菌SD-lb在制備葡萄酒中的應(yīng)用。
[0022] 將蘋(píng)果酸-乳酸細(xì)菌(酒酒球菌SD-lb)進(jìn)行pH、S02、酒精的抗性實(shí)驗(yàn)：具體做法 是，首先進(jìn)行pH、S02、酒精單因子實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行復(fù)合實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)逆境抗性強(qiáng)的蘋(píng)果酸 -乳酸細(xì)菌(酒酒球菌SD-lb)。本發(fā)明所述的各種抗性實(shí)驗(yàn)方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知 的方法。
[0023] 蘋(píng)果酸降解實(shí)驗(yàn)：將篩選出的菌株按107cfu/ml的接種量接入添加有3g/L的L-蘋(píng)果酸ATB培養(yǎng)基中（pH4. 8)，每隔24h進(jìn)行紙層析監(jiān)測(cè)，觀察蘋(píng)果酸斑點(diǎn)的變化，以蘋(píng)果酸 斑點(diǎn)消失時(shí)為蘋(píng)果酸分解完畢。
[0024] 蘋(píng)果酸-乳酸酶活力測(cè)定，表1為不同菌株蘋(píng)果酸一乳酸酶活比較：蘋(píng)果酸-乳酸酶活力的定義為：20°C條件下，在10ml的培養(yǎng)基中，蘋(píng)果酸-乳酸細(xì)菌(酒酒球菌 SD-lb)24h降解蘋(píng)果酸的毫克數(shù)與每毫升中活細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)值（logcfu/ml)的比值。試驗(yàn) 證明，SD-lb的蘋(píng)果酸-乳酸酶活力優(yōu)于對(duì)照菌株31DH。
[0025] 釀酒適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)（參見(jiàn)表2-表13):通過(guò)對(duì)蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵速率、蘋(píng)果酸降解 率、揮發(fā)酸生成量、葡萄酒中有機(jī)酸、丹寧、總酚以及顏色發(fā)生的變化、酒體柔和指數(shù)發(fā)生的 改變以及氨基酸代謝對(duì)葡萄酒質(zhì)量的影響等方面的綜合測(cè)定，結(jié)合品嘗分析，確定酒類(lèi)酒 球菌（Oenococcusoeni)SD_lb為釀酒特性優(yōu)良的菌株，該菌株已于2014年4月2日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào) 院3號(hào)，保藏號(hào)為：CGMCCN0. 8988,分類(lèi)命名為：酒類(lèi)酒球菌。
[0026] 表1不同菌株蘋(píng)果酸-乳酸酶活比較 TableIComparisonofMLAwithdifferentstrains
表4各菌株MLF酒樣揮發(fā)酸、總酸、pH比較 Table4Comparisonofvolatileacids,totalacidsandpHvaluesinwines afterMLFbydifferentstrains
表5不同菌株MLF酒樣中蘋(píng)果酸、乳