一株產(chǎn)角蛋白酶的副短短芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及一株產(chǎn)角蛋白酶的副短短芽孢桿菌及其粗酶性質(zhì)。
【背景技術】
[0002]角蛋白酶是一種能專一降解天然角蛋白的蛋白水解酶。角蛋白存在大量的二硫鍵、氫鍵和疏水作用，不容易被普通蛋白酶水解，因而大部分未被利用，有的甚至造成環(huán)境污染。
[0003]角蛋白酶可用于制革工業(yè)。目前制革工業(yè)中脫毛基本采用灰堿法，但是脫毛廢液中含有高濃度的硫化物，嚴重污染環(huán)境，而用酶法代替灰堿法脫毛便可徹底消除硫化物的污染，酶法具有清潔性、環(huán)境友好等特征，同時相比化學制革工藝更能提高產(chǎn)品的質(zhì)量，因此在制革中應用已越來越廣泛
角蛋白酶可用于醫(yī)藥行業(yè)。我國每年產(chǎn)生大量的家禽羽毛和廢次羊毛，其主要成分是角蛋白。角蛋白酶可將家禽羽毛、廢次羊毛降解轉變?yōu)榭扇艿鞍踪|(zhì)、多肽或者氨基酸，用作醫(yī)藥原料、動物飼料等，變廢為寶，減少環(huán)境污染。
[0004]目前已發(fā)現(xiàn)30多種微生物能分泌角蛋白酶，國內(nèi)外角蛋白酶的研究主要集中在真菌中的皮膚癬菌和白假絲酵母(Candida a處icaas)，放線菌中的鏈霉菌(Streptomyces)和高溫單胞菌屬(Therinonspora)及細菌中的地衣芽孢桿菌iBaciIIus licheniformis)和枯草芽抱桿菌subtilis~)等。
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)角蛋白酶的副短短芽孢桿菌，并初步研究了其使用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006](I)平板初篩:從江蘇無錫農(nóng)村羊圈采集土壤樣品，取I g 土樣添加到10 mL生理鹽水中，制備土壤懸液，稀釋涂布至初篩培養(yǎng)基平皿中，30°C培養(yǎng)3 do在分離平板上挑取能生長的較大的單菌落，劃線分離至純單菌落。
[0007](2)搖瓶復篩:初篩得到的菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵，測定其上清液角蛋白酶活力，發(fā)現(xiàn)7號菌酶活力較高。
[0008](3)菌株16S rDNA鑒定:提取總DNA，用細菌16S rDNA通用引物擴增，得到的基因序列，經(jīng)測序比對，為副短短芽孢桿菌{Brevibacillus parabrevis)，命名為R_7，于2015年5月11日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.10798。
[0009](4)菌株發(fā)酵條件初步優(yōu)化:利用單因素及正交實驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方為羊毛1%，可溶性淀粉1%，玉米粉1%，NaCl 0.15%，NH4Cl 0.05%, K2HPO4 0.03%, KH2PO4 0.04%, MgCl2.6Η20 0.01%。搖床培養(yǎng)條件為:初始 pH 值為8.0，接種量2%，培養(yǎng)溫度400C，轉速220 r/min，裝液量30 mL/250 mL，發(fā)酵周期16 h，產(chǎn)角蛋白酶活力達到412 U/mL。
[0010](5)酶學性質(zhì)研究:分別研究了作用溫度和作用PH對該酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)該角蛋白酶的最適作用溫度為40°C，最適pH為7.0。
[0011]其中步驟(I)中所述的初篩培養(yǎng)基為:羊毛粉0.5%，K2HPO4 0.1%，NaCl 0.05%，瓊脂粉2% ;步驟(2)中所述的復篩搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為=MgCl2.6H20 0.01%，K2HPO4 0.03%，KH2PO4 0.04%，NaCl 0.05%，NH4Cl 0.05%，羊毛 1%。
[0012]
【附圖說明】
[0013]圖1為溫度對酶活力的影響圖2為pH對酶活力的影響
【具體實施方式】
[0014]實施例1角蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選與鑒定
(I)培養(yǎng)基配方
①初篩培養(yǎng)基:羊毛粉0.5%，K2HPO4 0.1%，NaCl 0.05%，瓊脂粉2%。
[0015]②種子液體培養(yǎng)基
高氏培養(yǎng)基:可溶性淀粉 2%，KNO3 0.1%, NaCl 0.05%, K2HPO4 0.05%, MgSO4 7H20 0.05%,FeSO4.7 H2O 0.001%。
[0016]LB培養(yǎng)基:蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉1%。
[0017]察氏培養(yǎng)基:蔗糖3%，NaNO3 0.3%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 7H20 0.05%，KCl 0.05%，F(xiàn)eSO4 7 H2O 0.001%。
[0018]③初始發(fā)酵培養(yǎng)基:MgCl2.6H20 0.01%, K2HPO4 0.03%, KH2PO4 0.04%, NaCl 0.05%，NH4Cl 0.05%，羊毛 1%。
[0019](2)平板初篩及角蛋白活力測定
從無錫農(nóng)村羊圈采集土壤樣品，取I g 土樣添加到10 mL生理鹽水及玻璃珠的50 mL三角瓶中，搖床振蕩15 min待土樣分散后，靜置5 min，吸取I mL 土壤懸液至9 mL稀釋液(無菌生理鹽水)，得到10 2稀釋度懸液，依次按10倍稀釋法稀釋至10 ?,由此制得各稀釋度土壤懸液。分別吸取各稀釋度懸液0.1 mL至初篩培養(yǎng)基平板(放置過夜，無雜菌生長)，于30°C恒溫培養(yǎng)3 d，用接種環(huán)逐個挑取生長較大的形態(tài)各異的菌落至新的初篩培養(yǎng)基平板，反復劃線分離至單菌落。
[0020]經(jīng)初步分離純化，得到32株菌，其中13株為放線菌，18株為細菌，I株為真菌，選擇生長較良好的菌株繼續(xù)培養(yǎng)，最終得到18株菌。
[0021](3)搖瓶復篩
將初篩得到的18株菌株，分別采用高氏培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基進行培養(yǎng)活化制備種子液，按2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，300C，220 r/min培養(yǎng)64 h，測定發(fā)酵上清液角蛋白酶的活力，發(fā)現(xiàn)7號菌酶活力較高。
[0022](4)菌株形態(tài)
將該菌株在LB固體培養(yǎng)基上用涂布法進行接種培養(yǎng)，37°C條件下培養(yǎng)過夜，發(fā)現(xiàn)菌落呈白色、正圓形，表面光滑。革蘭氏染色為陽性。電鏡下觀察為短桿狀，有芽孢。
[0023](5) 16S rDNA 鑒定
提取總DNA，用細菌16S rDNA通用引物擴增，得到基因序列，經(jīng)測序比對，與副短短芽孢桿菌的16S rDNA序列同源性高達99%，初步判斷其為副短短芽孢桿菌{Brevibacillusparabrevis)，命名為 R-7。
[0024]
實施例2菌株發(fā)酵條件初步優(yōu)化
利用單因素及正交實驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方為羊毛 1%，可溶性淀粉 1%，玉米粉 1%，NaCl 0.15%，NH4Cl 0.05%，K2HPO4 0.03%，KH2PO40.04%，MgCl2.6H20 0.01%。搖床培養(yǎng)條件為:初始pH值為8.0，接種量2%，培養(yǎng)溫度40 °C，轉速220 r/min，裝液量30 mL/250 mL，發(fā)酵周期16 h，產(chǎn)角蛋白酶活力達到412 U/mL。
[0025]
實施例3酶學性質(zhì)研究
初步研究了所產(chǎn)角蛋白酶的粗酶酶學性質(zhì)，分別研究了作用溫度(30°C _70°C)和作用pH (6.0-10.0)對該酶活力的影響，研究結果發(fā)現(xiàn)，該角蛋白酶的最適作用溫度為40°C (圖
1)，最適pH為7.0 (圖2)。
【主權項】
1.一株角蛋白酶產(chǎn)生菌株副短短芽孢桿菌、Brevibacillus paraAreKis)，命名為副短短芽孢桿菌R-7，現(xiàn)保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.10798，保藏日期為2015年5月11日。2.保藏編號為CGMCCN0.10798的菌株的培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)基為:羊毛1%，可溶性淀粉1%，玉米粉 1%，NaCl 0.15%，NH4Cl 0.05%，K2HPO4 0.03%，KH2PO4 0.04%，MgCl2.6H20 0.01% ；培養(yǎng)條件為:初始PH值為8.0，接種量2%，培養(yǎng)溫度40°C，轉速220 r/min，裝液量30 mL/250mL，發(fā)酵周期16 h，產(chǎn)角蛋白酶活力達到412 U/mL。3.保藏編號為CGMCCN0.10798的菌株所產(chǎn)的角蛋白酶液的最適作用溫度為40°C，最適pH為7.00
【專利摘要】本發(fā)明公開一株角蛋白產(chǎn)生菌株及其培養(yǎng)條件和酶學性質(zhì)，屬于微生物技術領域。經(jīng)鑒定，該菌株為副短短芽孢桿菌(<i>Brevibacillus？parabrevis</i>)，命名為副短短芽孢桿菌R-7，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC？No.10798。經(jīng)初步優(yōu)化，該菌株的培養(yǎng)基為：羊毛1%，可溶性淀粉1%，玉米粉1%，NaCl？0.15%，NH4Cl？0.05%，K2HPO4？0.03%，KH2PO4？0.04%，MgCl2·6H2O？0.01%。搖床培養(yǎng)條件為：初始pH值為8.0，接種量2%，培養(yǎng)溫度40℃，轉速220r/min，裝液量30mL/250mL，發(fā)酵周期16h，產(chǎn)角蛋白酶活力達到412U/mL。該角蛋白酶最適作用溫度為40℃，最適pH為7.0。該酶在制革及醫(yī)藥等領域具有重要應用。
【IPC分類】C12R1/01, C12N9/48, C12N1/20
【公開號】CN105112344
【申請?zhí)枴緾N201510639836
【發(fā)明人】龔勁松, 侯瓔朔, 羅陽, 翟靖鑫, 張楠, 朱佳能, 史勁松, 許正宏, 李恒
【申請人】江南大學
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年10月8日