獼猴桃AdADH2基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及獼猴桃AdADH2基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 獼猴桃屬于獼猴桃科（Actinidiaceae)獼猴桃屬（Actinidia)落葉性藤本果樹， 全世界獼猴桃屬植物有54個(gè)種21個(gè)變種，共約75個(gè)分類單位，種質(zhì)資源極其豐富。1904 年，新西蘭從我國引種獼猴桃，人工馴化，開始品種選育工作和商業(yè)化生產(chǎn)。目前市場上栽 培的主要品種大多選自于美味獼猴桃和中華獼猴桃，還有少量選自軟棗獼猴桃。獼猴桃由 于含有極其豐富的營養(yǎng)價(jià)值，尤其是Vc含量很高，被譽(yù)為"Vc之王"，所以越來越受到人們 的青睞。
[0003] 江蘇省夏季雨季較長，雨水較多，給獼猴桃生長生產(chǎn)帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。2011年， 由于雨季雨水較多，澇害嚴(yán)重，揚(yáng)州市大量成年獼猴桃植株死亡，給果農(nóng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì) 損失。因此，獼猴桃的耐澇問題是制約江蘇省獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。選育耐澇 性砧木和品種資源無疑是解決該問題的主要途徑。隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)在果樹 領(lǐng)域的應(yīng)用，應(yīng)用基因工程技術(shù)手段來改造獼猴桃的抗性，是今后抗性研究的目標(biāo)。因此， 挖掘和研究獼猴桃耐澇基因?qū)?huì)為通過基因工程技術(shù)手段培育獼猴桃耐澇性砧木和品種 資源奠定理論基礎(chǔ)。
[0004]目前，有關(guān)植物耐澇基因篩選方面的研究較少，關(guān)于耐澇基因的表達(dá)與調(diào)控方面 的研究更是微乎其微。獼猴桃品種'金魁'是我國選育的美味獼猴桃品種之一，抗旱、耐澇、 抗凍能力較強(qiáng)。在獼猴桃耐澇基因挖掘方面的研究還未見報(bào)道。因此克隆和研究獼猴桃抗 逆相關(guān)基因，對(duì)于開發(fā)具有中國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的果樹抗逆基因具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：
[0006] 本發(fā)明的目的是提供獼猴桃AdADH2。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供該獼猴桃AdADH2的編碼基因。
[0008] 本發(fā)明的又一目的是提供該基因的功能。
[0009] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 本發(fā)明所提供的獼猴桃AdADH2,來源于獼猴桃優(yōu)良品種'金魁'，氨基酸序列如SEQ IDN0. 2 所示。
[0011] 本發(fā)明所述的獼猴桃AdADH2的編碼基因，其cDNA序列如SEQIDNO. 1所示，含有 1143bp的最大開放閱讀框，編碼SEQIDNO. 2所示的380個(gè)氨基酸殘基序列。
[0012] 含有本發(fā)明AdADH2基因的表達(dá)載體。
[0013] 所述的表達(dá)載體優(yōu)選將所述的獼猴桃AdADH2的編碼基因插入到pCAMBIA1301載 體的KpnI和SacI酶切位點(diǎn)間所得。
[0014] 宿主菌是指將含有本發(fā)明AdADH2基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入的根癌農(nóng)桿菌EHA105.
[0015] 擴(kuò)增AdADH2cDNA全長的引物為：
[0016] AdADH2-0RFsense:5'-CATAGAGTTCTGTTTTCAGTGAAG-3'
[0017]AdADH2-0RFantisense:5'-TGAAAAGTATTGTAGGCAGATTAC-3'
[0018] 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析中涉及的AdADH2的qPCR引物為：
[0019] AdADH2-qPCRsense:5,-CTGAAATGACCAGCGGAGGAG-3'
[0020] AdADH2-qPCRantisense:5'-TGTCTTGAATACGGCATCTTTGTG-3'
[0021] 上述獼猴桃AdADH2、其編碼基因、含有編碼基因的表達(dá)載體、宿主菌在培育耐澇或 耐鹽植物中的應(yīng)用。
[0022] 有益效果：
[0023] 本發(fā)明在金魁獼猴桃中克隆到一個(gè)AdADH2基因，AdADH2參與獼猴桃耐澇和耐鹽 脅迫過程。
[0024]AdADH2編碼基因在澇害脅迫、低溫脅迫、和鹽害脅迫誘導(dǎo)條件下表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南 芥中過量表達(dá)AdADH2編碼基因，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)耐澇、耐鹽的特性。這一結(jié) 果說明AdADH2基因參與植物抵抗?jié)澈螓}害脅迫過程中起著非常重要的作用。
[0025] 本發(fā)明的AdADH2對(duì)于培育耐澇或耐鹽植物品種或植物改良品種具有重要意義， 在作物育種方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0026] 利用本發(fā)明的植物表達(dá)載體，將AdADH2基因?qū)胫参矬w內(nèi)，可以獲得耐澇和耐鹽 的轉(zhuǎn)基因植株。
【附圖說明】
[0027] 圖1AdADH2基因在獼猴桃澇害（A)、低溫⑶和高鹽（C)脅迫下的表達(dá)特性
[0028] 圖2轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在澇害脅迫處理?xiàng)l件下的表型觀察
[0029]ADH2-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；A:處理前表型；B:澇害處理2周后 表型；C:恢復(fù)生長1周后表型。
[0030] 圖3轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在澇害脅迫處理后恢復(fù)生長1周后的根長（A)、 鮮重（B)和干重（C)的統(tǒng)計(jì)分析
[0031]ADH2-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
[0032]圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在鹽脅迫處理?xiàng)l件下的發(fā)芽情況分析
[0033]ADH2-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
[0034] 圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在鹽脅迫處理?xiàng)l件下的發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)分析
[0035]ADH2-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下列實(shí)例中所有的方法無特別說明，均為常規(guī)方法
[0037] 實(shí)施例1獼猴桃AdADH2基因的克隆與鑒定
[0038] 實(shí)驗(yàn)材料為獼猴桃品種'金魁'扦插苗，對(duì)其進(jìn)行澇害處理0天，1天，2天，4天 后，取其根部組織，參考蔡斌華等改進(jìn)的CTAB法（蔡斌華，張計(jì)育，高志紅，渠慎春，佟兆國， 靡林，喬玉山，章鎮(zhèn).一種改良的提取草莓屬葉片總RNA的方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008， 24(6) :875-877)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道物種的序列，在ADH2最大開放閱 讀框兩端分別設(shè)計(jì)引物AdADH2-0RFsense:5' -CATAGAGITCTGTITTCAGTGAAG-3'（SEQID N0.3)和AdADH2-0RFantisense:5'-TGAAAAGTAITGTAGGCAGATTAC-3'（SEQIDN0.4)。以 cDNA為模板，進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：94°C5min熱變性；94°C45s，58°C45s，72°C90s，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸15min。將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒（Genscript)回收后，與pMD19-T載 體（Takara,Japan)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸菌DH5a，挑選陽性克隆，進(jìn)行測序。測序得到的片 段長度為1221bp(SEQIDNO. 5)，含有1143bp的最大開放閱讀框（SEQIDNO. 1)，編碼380 個(gè)氨基酸殘基序列（SEQIDNO. 2)。
[0039] 實(shí)施例2獼猴桃AdADH2基因在澇害、低溫和高鹽脅迫條件下的表達(dá)特性
[0040] 以獼猴桃品種'金魁'為材料，對(duì)其進(jìn)行澇害、低溫（4°C)、高鹽（200mMNaCl) 處理，處理后取其葉片，提取RNA，cDNA的合成用能消除