獼猴桃AdADH1基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及獼猴桃AdADHI基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 獼猴桃屬于獼猴桃科（Actinidiaceae)獼猴桃屬（Actinidia)落葉性藤本果樹(shù)， 全世界獼猴桃屬植物有54個(gè)種21個(gè)變種，共約75個(gè)分類單位，種質(zhì)資源極其豐富。1904 年，新西蘭從我國(guó)引種獼猴桃，人工馴化，開(kāi)始品種選育工作和商業(yè)化生產(chǎn)。目前市場(chǎng)上栽 培的主要品種大多選自于美味獼猴桃和中華獼猴桃，還有少量選自軟棗獼猴桃。獼猴桃由 于含有極其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尤其是Vc含量很高，被譽(yù)為"Vc之王"，所以越來(lái)越受到人們 的青睞。
[0003] 江蘇省夏季雨季較長(zhǎng)，雨水較多，給獼猴桃生長(zhǎng)生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。2011年， 由于雨季雨水較多，澇害嚴(yán)重，揚(yáng)州市大量成年獼猴桃植株死亡，給果農(nóng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì) 損失。因此，獼猴桃的耐澇問(wèn)題是制約江蘇省獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。選育耐澇 性砧木和品種資源無(wú)疑是解決該問(wèn)題的主要途徑。隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)在果樹(shù) 領(lǐng)域的應(yīng)用，應(yīng)用基因工程技術(shù)手段來(lái)改造獼猴桃的抗性，是今后抗性研究的目標(biāo)。因此， 挖掘和研究獼猴桃耐澇基因?qū)?huì)為通過(guò)基因工程技術(shù)手段培育獼猴桃耐澇性砧木和品種 資源奠定理論基礎(chǔ)。
[0004]目前，有關(guān)植物耐澇基因篩選方面的研究較少，關(guān)于耐澇基因的表達(dá)與調(diào)控方面 的研究更是微乎其微。獼猴桃品種'金魁'是我國(guó)選育的美味獼猴桃品種之一，抗旱、耐澇、 抗凍能力較強(qiáng)。在獼猴桃耐澇基因挖掘方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此克隆和研究獼猴桃抗 逆相關(guān)基因，對(duì)于開(kāi)發(fā)具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的果樹(shù)抗逆基因具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種獼猴桃AdADHI蛋白。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供該獼猴桃AdADHI蛋白的編碼基因。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供該基因、蛋白的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明所提供的獼猴桃AdADHI蛋白，來(lái)源于獼猴桃優(yōu)良品種'金魁'，氨基酸序列 如SEQIDN0.2所示。
[0010] 本發(fā)明所述的獼猴桃AdADHI蛋白的編碼基因，其cDNA序列如SEQIDNO. 1所示， 含有1143bp的最大開(kāi)放閱讀框，編碼SEQIDNO. 2所示的380個(gè)氨基酸殘基序列。
[0011] 含有本發(fā)明AdADHI蛋白的編碼基因的表達(dá)載體，優(yōu)選含有SEQIDNO. 1所示的 AdADHI蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。
[0012] 所述的表達(dá)載體進(jìn)一步優(yōu)選將所述的獼猴桃AdADHI蛋白的編碼基因插入到 PCAMBIA1301載體的KpnI和SacI酶切位點(diǎn)間所得。
[0013] 含有本發(fā)明AdADHI蛋白的編碼基因的宿主菌。
[0014] 所述的宿主菌優(yōu)選將pCAMBIA1301-AdADHl轉(zhuǎn)入的根癌農(nóng)桿菌EHA105.
[0015] 擴(kuò)增AdADHlcDNA全長(zhǎng)的引物為：
[0016] AdADHl-ORFsense:5'-GGAGTTTGTGAGAGAAGTTAGAG-3'
[0017] AdADHl-ORFantisense:5'-AGATTTCACCAGCAAACTCAC-3'
[0018] 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析中涉及的AdADHl的qPCR引物為：
[0019] AdADHl-qPCRsense:5'-TGGAGTGTACTGGAAGTGTCAATG-3'
[0020] AdADHl-qPCRantisense:5,-AGCAGGGAGGTCGGAACG-3'
[0021] 上述獼猴桃AdADHl蛋白、其編碼基因、含有編碼基因的表達(dá)載體、含有該編碼基 因的宿主菌在培育耐澇、耐低溫或耐鹽植物中的應(yīng)用。
[0022] 有益效果：
[0023] 本發(fā)明在金魁獼猴桃中克隆到一個(gè)AdADHl蛋白的編碼基因，AdADHl參與獼猴桃 耐澇、耐低溫和耐鹽脅迫過(guò)程。
[0024] AdADHl的編碼基因在澇害脅迫、低溫脅迫、和鹽害脅迫誘導(dǎo)條件下表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬 南芥中過(guò)量表達(dá)AdADHl的編碼基因，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)耐澇、耐鹽和耐低溫 的特性。這一結(jié)果說(shuō)明AdADHl的編碼基因參與植物抵抗?jié)澈?、低溫或鹽害脅迫過(guò)程中起著 非常重要的作用。
[0025] 本發(fā)明的AdADHl的編碼基因?qū)τ谂嘤蜐?、耐低溫、或耐鹽植物品種或植物改良 品種具有重要意義，在作物育種方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0026] 利用本發(fā)明的植物表達(dá)載體，將AdADHl的編碼基因?qū)胫参矬w內(nèi)，可以獲得耐 澇、耐低溫和耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1AdADHl基因在獼猴桃澇害（A)、低溫⑶和高鹽（C)脅迫下的表達(dá)特性
[0028]圖2轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在澇害脅迫處理?xiàng)l件下的表型觀察
[0029] ADH1-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；A:處理前表型；B:澇害處理2周后 表型；C:恢復(fù)生長(zhǎng)1周后表型。
[0030] 圖3轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在澇害脅迫處理后恢復(fù)生長(zhǎng)1周后的根長(zhǎng)（A)、 鮮重（B)和干重（C)的統(tǒng)計(jì)分析
[0031]ADH1-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
[0032] 圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在低溫（_20°C)脅迫處理?xiàng)l件下的表型觀察
[0033]ADH1-3:轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；A:處理前表型；B:-20°C處理5h，恢 復(fù)生長(zhǎng)16h后表型。
[0034] 圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在低溫（_20°C)脅迫處理5h，恢復(fù)生長(zhǎng)16h后 的萎蔫率
[0035]ADH1-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
[0036]圖6轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在鹽脅迫處理?xiàng)l件下的發(fā)芽情況分析
[0037]ADH1-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
[0038]圖7轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在鹽脅迫處理?xiàng)l件下的發(fā)根情況分析
[0039]ADH1-3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
[0040] 圖8轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在鹽脅迫處理?xiàng)l件下的發(fā)芽率和根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)分 析
[0041]ADH1-3:轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；WT:野生型株系；
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下列實(shí)例中所有的方法無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法
[0043] 實(shí)施例1獼猴桃AdADHl基因的克隆與鑒定
[0044] 實(shí)驗(yàn)材料為獼猴桃品種'金魁'扦插苗，對(duì)其進(jìn)行澇害處理0天，1天，2天，4天 后，取其根部組織，參考蔡斌華等改進(jìn)的CTAB法（蔡斌華，張計(jì)育，高志紅，渠慎春，佟兆國(guó)， 靡林，喬玉山，章鎮(zhèn).一種改良的提取草莓屬葉片總RNA的方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008， 24(6) :875-877)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道物種的序列，在ADH1最大開(kāi)放閱讀 框兩端分別設(shè)計(jì)引物AdADHl-ORFsense:5'-GGAGITTGTGAGAGAAGTTAGAG-3'（SEQIDN0.3) 和AdADHl-ORFantisense:5'-AGATTTCACCAGCAAACTCAC-3'（SEQIDNO. 4)。以cDNA為 模板，進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：94°C5min熱變性；94°C45s，58°C45s，72°C90s，共35個(gè)循 環(huán)；72°C延伸15min。將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒（Genscript)回收后，與pMD19-T載體 (Takara，Japan)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸菌DH5a，挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的片段 長(zhǎng)度為1283bp(SEQIDN0. 5)，含有1143bp的最大開(kāi)放閱讀框（SEQIDNO. 1)，編碼380個(gè) 氨基酸殘基序列（SEQIDN0. 2)。
[0045] 實(shí)施例2獼猴桃AdADHl基因在澇害、低溫和高鹽脅迫條件下的表達(dá)特性
[0046] 以獼猴桃品種'金魁'為材料，對(duì)其進(jìn)行澇害、低溫（4°C)、高鹽（200mMNaCl) 處理，處理后取其葉片，提取RNA，cDNA的