一種高效提取搖蚊幼蟲dna的方法
【專利說明】
[0001]本發(fā)明得到天津市自然科學(xué)基金（14JCQNJC14600)、國家自然科學(xué)基金 (31101653，31272284)、天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金（20090608)以及天津師范大學(xué)引進 人才基金（5RL104)、大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（201410065046)和天津市優(yōu)秀青年教師資 助計劃（2013)等項目資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于動物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于高效提取搖蚊幼蟲DNA 的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 搖蚊隸屬于昆蟲綱雙翅目長角亞目（Diptera:Nematocera)，成蟲體形與蚊蟲相 似，因其口器退化而有"不咬人的蠓蟲"之稱。因成蟲靜止時前足不停擺動而得名，故稱為 搖蚊。搖蚊與人類生活息息相關(guān)。搖蚊科幼蟲的生態(tài)需求和生活習(xí)性因種屬的不同而存在 差異，對環(huán)境因子敏感性不同，是水環(huán)境監(jiān)測的優(yōu)良指示生物之一。此外，在水產(chǎn)生產(chǎn)中，搖 蚊可以作為經(jīng)濟魚類的餌料，具有很高的經(jīng)濟價值。
[0004] 搖蚊為完全變態(tài)發(fā)育昆蟲，多種物種幼蟲和蛹形態(tài)相似、同一物種不同發(fā)育階段 數(shù)據(jù)缺乏等問題都為搖蚊的物種鑒定帶來困擾。DNA條形碼技術(shù)自2003年提出以來，發(fā)展 迅速，被廣泛應(yīng)用于動植物的分類鑒定。條形碼數(shù)據(jù)的獲得一般包括以下幾個步驟：提取總 DNA，PCR擴增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳和微量蛋白核酸儀檢測，割膠回收純化，測序，分析 和處理數(shù)據(jù)這些步驟。其中，提取總DNA這一步非常關(guān)鍵，提取總DNA的濃度和純度直接影 響到后續(xù)實驗。提取DNA時可采用傳統(tǒng)方法（如CTAB、NaCl、SDS法）和試劑盒法。傳統(tǒng)方 法和試劑盒法各有利弊，但在提取搖蚊幼蟲DNA中，二者效果均不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高效提取搖蚊幼蟲DNA的方法。為達成這個目標(biāo)，本發(fā) 明采用的是增加預(yù)處理，并在原有傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上加以改進，從而可以獲得高質(zhì)量的搖 蚊幼蟲DNA。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 一種高效提取搖蚊幼蟲DNA的方法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 增加預(yù)處理：取單只搖蚊幼蟲，用解剖針盡可能將其腸道全部拉出棄掉；用蒸餾水 浸泡蟲體，每5min換一次蒸餾水，換兩次共計15min; (2) 將（1)所得幼蟲放置1.5mlEp管內(nèi)，加裂解液，用研磨棒對幼蟲進行研磨，研磨充 分； (3) 加入20ul蛋白酶K和15ulRNA酶，混勻，置于56°C水浴鍋中進行過夜消化處 理； (4) 按體積比24:1的氯仿：異戊醇抽提兩次； (5) 加300yl飽和酚、300yl氯仿：異戊醇抽提一次； (6) 加0. 5體積異丙醇冰上沉淀； (7) 70%乙醇洗滌兩次； (8) 烘箱37°C烘干，加30ulddH20 (37°C)對DNA進行溶解。其中裂解液（100ml)的 組成如下： CTAB 2g終濃度 2% SDS 0.5g終濃度 0?5% 0. 5MEDTA6ml 終濃度 0? 03M 1MTris-HCl10ml 終濃度 0? 1M 5MNaCl20ml 終濃度 1M PVPlg終濃度 1% 巰基乙醇 0.1ml終濃度 0.1% 蒸餾水補至 100ml。
[0006] 本發(fā)明所述高效提取搖蚊幼蟲DNA的方法，可從單只搖蚊幼蟲體內(nèi)獲得高質(zhì)量 DNA，可直接用于PCR反應(yīng)擴增出線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因（C0I基因）。
[0007] 本發(fā)明更加詳細的描述如下： (1)增加預(yù)處理：取單只搖蚊幼蟲，做頭殼裝片時，用解剖針盡可能將其腸道全部拉出 棄掉，防止腸道內(nèi)消化物對后續(xù)實驗造成干擾；用蒸餾水浸泡蟲體，每5min換一次蒸餾 水，換兩次共計15min，以去除蟲體上的雜質(zhì)。
[0008] (2)將1所得幼蟲放置1. 5mlEp管內(nèi)，加裂解液，用研磨棒對幼蟲進行研磨，研磨 充分。
[0009] (3)加入20ul蛋白酶K和15ulRNA酶，混勻，置于56°C水浴鍋中進行過夜消化 處理。在剛開始水浴加熱的2h內(nèi)，每10min對樣品手動顛倒混合搖勻一次。
[0010] (4)加入450ul氯仿：異戊醇（24:1)，充分混勾，靜置10min，12000rpm離心20 min，取上清。重復(fù)此操作一次。
[0011] (5)加300yl飽和酚、300yl氯仿：異戊醇，上下顛倒充分混勻，靜置10min， 離心取上清。
[0012] (6)加0?5體積異丙醇，混勾，冰上沉淀30min，12000rpm離心20min，棄上清。
[0013] (7)加 600ul70% 乙醇，12000rpm離心 20min，棄上清。重復(fù)一次。
[0014] (8)烘箱 37°C烘干，加 30ulddH20 (37°C)對DNA進行溶解。
[0015] (9)PCR擴增C0I基因并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0016] 本發(fā)明重點考察了裂解液的配置以及蛋白酶K和RNA酶的消化時間對提取搖蚊幼 蟲DNA的影響，搖蚊幼蟲蛋白含量高增加蛋白抽提次數(shù)對提取搖蚊幼蟲DNA的影響，因此解 決了搖蚊幼蟲DNA提取質(zhì)量低下的問題。
[0017] 本發(fā)明公開的搖蚊幼蟲DNA提取方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于： (1)成本低。裂解液成分均有市售，自己配置成本比用試劑盒成本要低。
[0018] (2)質(zhì)量好。用此方法提取搖蚊幼蟲DNA，PCR擴增C0I基因成功率極高。
【附圖說明】
[0019] 圖1PCR擴增C0I基因。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專 業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應(yīng)視為在本 發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定。所用各種原料均有市售：
實施例1 :搖蚊幼蟲DNA提取
[0021] (1)預(yù)處理： a.取單只搖蚊幼蟲，做頭殼裝片時，用解剖針盡可能將其腸道全部拉出棄掉，防止腸道 內(nèi)消化物對后續(xù)實驗造成干擾。
[0022] b.用蒸餾水浸泡蟲體，每5min換一次蒸餾水，換兩次共計15min，以去除蟲體上 的雜質(zhì)。最后用吸水紙將蟲體表面蒸餾水吸干。
[0023] (2)將1所得幼蟲放置1. 5mlEp管內(nèi)，加200ul裂解液，用已滅菌的研磨棒對幼 蟲進行研磨，研磨充分。再加200ul裂解液沖洗研磨棒。
[0024] (3)加入20ul蛋白酶K和15ulRNA酶，混勻，置于56°C水浴鍋中進行過夜消化 處理。在剛開始水浴加熱的2h內(nèi)，每10min對樣品手動顛倒混合搖勻一次。
[0025] (4)加入450ul氯仿：異戊醇（24:1)，充分混勾，靜置10min，12000rpm離心20 min，取上清。
[0026] (5)重復(fù)（4)。
[0027] (6)加300yl飽和酚、300yl氯仿：異戊醇，上下顛倒充分混勻，靜置10min， 離心取上清。
[0028] (7)加0. 5體積異丙醇，混勾，冰上沉淀30min，12000rpm離心20min，棄上清。
[0029] (8)加 600ul70% 乙醇，12000rpm離心 20min，棄上清。重復(fù)一次。
[0030] (9)烘箱37°C烘干，加30ulddH20 (37°C)對DNA進行溶解。將得到的DNA產(chǎn)物 置于冰箱_20°C保存。
[0031] 實施例2: PCR擴增線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因（C0I基因） (l)PCR反應(yīng)體系： 總體系 25ul:ddH20 16. 2ul，10xPCRBuffer2. 5ul，dNTPs(2. 5mmol/L) 2ul， 通用引物L(fēng)CO和HC0(10umol/L)各1ul，Taq酶（500U，2.5U/ul)0.3ul，DNA模板 2ul〇
[0032] (2)PCR反應(yīng)條件： 94°C預(yù)變性 5min;94°C變性 40s;56°C退火 40s;72°C延伸 1min;30 個循環(huán)；72°C延伸5min;4°C保存。
[0033] (3)配置1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，見附圖。
[0034] 結(jié)果說明： (1)電泳圖第1泳道為8KpMarker，第2、3、4、5泳道分別為單只紅裸須搖蚊幼蟲提取DNA之后的PCR結(jié)果。
[0035] (2)C0I基因約為698bp，在Marker第1、2條帶之間，結(jié)果符合預(yù)期。
[0036] 實施例3 對比試驗
結(jié)論：本發(fā)明的方法較常規(guī)方法DNA濃度高，純度高。
【主權(quán)項】
1. 一種高效提取搖蚊幼蟲DNA的方法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 增加預(yù)處理：取單只搖蚊幼蟲，用解剖針盡可能將其腸道全部拉出棄掉，防止腸道 內(nèi)消化物對后續(xù)實驗造成干擾；用蒸餾水浸泡蟲體，每5 min換一次蒸餾水，換兩次共計15 min，以去除蟲體上的雜質(zhì)； (2) 將（1)所得幼蟲放置1.5 ml Ep管內(nèi)，加裂解液，用研磨棒對幼蟲進行研磨，研磨充 分； (3) 加入20 ul蛋白酶K和15 ul RNA酶，混勻，置于56°C水浴鍋中進行過夜消化處 理； (4) 按體積比24:1的氯仿：異戊醇抽提兩次； (5) 加300 yl飽和酚、300 yl氯仿：異戊醇抽提一次； (6) 加0. 5體積異丙醇冰上沉淀； (7) 70%乙醇洗滌兩次； (8) 烘箱37°C烘干，加30 ul CldH2O (37°C )對DNA進行溶解。2. 權(quán)利要求1所述高效提取搖蚊幼蟲DNA的方法，其中裂解液（100 ml)的組成如下： CTAB 2g 終濃度 2% SDS 0. 5g 終濃度 0? 5% 0. 5M EDTA 6 ml 終濃度 0? 03M IM Tris-HCl 10 ml 終濃度 0? IM 5M NaCl 20 ml 終濃度 IM PVP Ig 終濃度 1% 0-巰基乙醇0.1ml 終濃度 0.1% 蒸餾水補至 100 ml。3. 權(quán)利要求1所述高效提取搖蚊幼蟲DNA的方法其特征在于：可從單只搖蚊幼蟲體內(nèi) 獲得高質(zhì)量DNA，可直接用于PCR反應(yīng)擴增出線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因（C0I基 因)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效提取搖蚊幼蟲DNA的方法，它是取單只搖蚊幼蟲，用解剖針盡可能將其腸道全部拉出棄掉，用蒸餾水浸泡蟲體，將所得幼蟲放置1.5mlEp管內(nèi)，加裂解液，用研磨棒對幼蟲進行研磨，研磨充分。再加入20ul蛋白酶K和15ulRNA酶，混勻，置于56℃水浴鍋中進行過夜消化處理。氯仿、異戊醇抽提兩次。再加300μl飽和酚、300μl氯仿：異戊醇抽提一次。最后加0.5體積異丙醇冰上沉淀。再經(jīng)過70%乙醇洗滌后，烘箱37℃烘干，加30ulddH2O（37℃）對DNA進行溶解。采用本發(fā)明能夠獲得搖蚊幼蟲高質(zhì)量DNA，可直接用于PCR反應(yīng)擴增COI基因。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105112401
【申請?zhí)枴緾N201510563452
【發(fā)明人】閆春財, 閆嬌, 戈昕宇, 郭琴
【申請人】天津師范大學(xué)
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年9月8日