一種單分子靶向測序中靶向引物的固定方法、單分子靶向測序試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種單分子靶向測序中靶向引物的固定 方法、單分子靶向測序試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 單分子測序技術(shù)被譽(yù)為第三代測序技術(shù)，其顯著特征是可以高保真地對DNA片段 直接進(jìn)行識別，單分子測序技術(shù)由于能識別到單個核酸分子，其具有比第二代測序技術(shù)更 高的檢測靈敏度。DNA芯片的固定是單分子測序的第一步，DNA在芯片上的固定質(zhì)量及密度 決定著后續(xù)的單分子測序能否順利進(jìn)行。為此國內(nèi)外研究人員致力于對芯片表面進(jìn)行改性 在表面引入各種官能團(tuán)，如氣基、酸基、駿基、疏基等形成孔狀的立體網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，使DNA與芯 片表面的官能團(tuán)共價結(jié)合進(jìn)而穩(wěn)定地固化于芯片的基底表面，提高DNA固定的密度。
[0003] 世界上首個基于單分子測序技術(shù)（tSMS)的測序儀是由Helicos公司于2008年推 向市場的。其原理是通過檢測單個堿基熒光信號來實(shí)現(xiàn)邊合成邊測序。其中Helicos公司 的單分子測序儀的固定技術(shù)中所用的引物為修飾有氨基的P〇lyT序列或與待測DNA互補(bǔ)的 DNA序列，然而，發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)表明，修飾有氨基的polyT的DNA很容易固定到表面修飾有 環(huán)氧基團(tuán)的基底表面，固定密度可以達(dá)到3000~5000/視野，但在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，若將 修飾有氨基的P〇lyT引物更換為待測DNA互補(bǔ)的引物序列后，其固定密度只有100~200/ 視野。
[0004] 為此，針對單分子靶向測序中與待測DNA序列互補(bǔ)的引物，需要進(jìn)一步改進(jìn)其固 定技術(shù)，以推動單分子靶向測序技術(shù)（SMTS)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種單分子靶向測序中靶向引物的固定方法、單分子靶向 測序試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明提供的靶向引物的固定方法，通過在固定的靶向引物的5'端加 了一定數(shù)目的PolyT，對靶向引物的固定密度均勻，固定密度可達(dá)2500~3200點(diǎn)/視野。
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供了一種單分子靶向測序中靶向引物的固定方法，包括以下 步驟：
[0007] (1)將一基底浸泡在含〇? 4~3. 2nM靶向引物的固定液中，之后清洗基底，
[0008] 其中，所述革巴向引物為5'端具有10~30bp的polyT的引物序列，所述引物序列 為與模板核酸的至少部分序列互補(bǔ)的序列；
[0009] (2)將清洗后的基底浸入磷酸鹽鈍化液中進(jìn)行鈍化；之后再清洗基底，獲得表面 固定有靶向引物的基底。
[0010] 如本發(fā)明所述的，所述革巴向引物為5'端具有10~30bp的polyT的引物序列。在 該實(shí)施方式中，靶向引物為5'端連接到基底表面的方式為：polyT的5'端修飾的氨基與基 底表面的環(huán)氧基連接。
[0011] 優(yōu)選地，所述靶向引物為5'端順次連接有10~30bp的polyT以及烷基鏈的引物 序列，其中，所述引物序列為與模板核酸的至少部分序列互補(bǔ)的序列。
[0012] 優(yōu)選地，所述烷基鏈為_(CH2)n-的烷基鏈，其中，n為自然數(shù)。
[0013] 更優(yōu)選地，所述靶向引物為5'端順次連接有10bp的polyT以及烷基鏈 為-(CH2)6-的引物序列，其中，所述引物序列為與模板核酸的至少部分序列互補(bǔ)的序列。
[0014] 在該實(shí)施方式中，靶向引物為5'端連接到基底表面的方式為：-(CH2)6-通過氨基 與基底表面的環(huán)氧基連接。
[0015] 優(yōu)選地，所述靶向引物為通過5'端修飾的氨基連接到表面修飾有環(huán)氧基的基底。 所述基底包括但不限于玻璃基底、石英基底等。
[0016] 優(yōu)選地，步驟（1)中，所述固定液為0? 02~0? 3M的K2HP04溶液。
[0017] 優(yōu)選地，步驟（1)中，所述固定液中靶向引物的濃度為0. 8~3. 2nM，進(jìn)一步優(yōu)選為 0. 8 ~1. 6nM。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（1)中，依次采用3xSSC與0? 1 %的Triton組成的混合溶液、3x的 SSC及濃度為150mM、pH= 8. 5的K2HP04來清洗基底。
[0019] SSC(salinesodiumcitrate)是分子生物學(xué)上最為標(biāo)準(zhǔn)的印跡及分子雜交處理 液，20xSSC用于雜交實(shí)驗(yàn)變性及清洗常用濃縮型緩沖液。其中，20xSSC的配制方法為：在 800ml水中溶解175. 3gNaCl和88. 2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值 至7.0,加水定容至1L。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（2)中，所述鈍化的時間為6~24小時。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（2)中，所述鈍化是在搖晃條件下鈍化10~15小時。
[0022] 更優(yōu)選地，步驟（2)中，所述鈍化具體為：將清洗后的基底浸入磷酸鹽鈍化液中， 并置于40~80rpm/min的搖床上搖晃10~15小時。
[0023] 優(yōu)選地，步驟⑵中，所述磷酸鹽鈍化液為0. 2~1. 0M的K2HP04溶液。
[0024] 更優(yōu)選地，步驟（2)中，所述磷酸鹽鈍化液為pH= 9. 0、濃度為1M的K2HP04溶液。
[0025] 優(yōu)選地，步驟（2)中，依次用PBS溶液、150mM的HEPES緩沖液與150mM的NaCl溶 液組成的混合溶液及雙蒸水來清洗基底。
[0026] 第二方面，本發(fā)明提供了一種單分子靶向測序試劑盒，包括基底、靶向引物和固定 反應(yīng)試劑。
[0027] 所述靶向引物為5'端具有10~30bp的polyT的引物序列，所述引物序列為與模 板核酸的至少部分序列互補(bǔ)的序列。
[0028] 可以理解的是，所述單分子靶向測序試劑盒還包括緩沖液或其他測序必要試劑。 比如，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要分別配置針對的固定反應(yīng)試劑、延伸反應(yīng)試劑、切除光學(xué)檢 測標(biāo)記分子等不同過程的緩沖液。
[0029] 第三方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的單分子靶向測序中靶向引物的固 定方法在DNA或RNA測序中的用途。
[0030] 本發(fā)明第一方面提供的靶向引物的固定方法在用于單分子測序時，單分子靶向測 序方案無需在模板核酸的3'末端加上polyA，只需通過靶向引物即可捕獲模板核酸，實(shí)現(xiàn) 實(shí)時測序，可使固定密度達(dá)到2500-3200點(diǎn)/視野以上。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的單分子測序中靶向引物的固定方法的流程示意圖；
[0032] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例對靶向引物進(jìn)行固定的原理圖；
[0033] 圖3~6為本發(fā)明實(shí)施例提供的核酸芯片的固定反應(yīng)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 結(jié)合圖1，本發(fā)明提供的單分子靶向測序中靶向引物的固定方法，包括以下步驟：
[0035] (1)將一基底浸泡在含0. 4~3. 2nM靶向引物的固定液中，之后清洗基底，
[0036] 其中，所述靶向引物為5'端具有10~30bp的polyT的引物序列，所述引物序列 為與模板核酸的至少部分序列互補(bǔ)的序列；
[0037] (2)將清洗后的基底浸入磷酸鹽鈍化液中進(jìn)行鈍化；之后再清洗基底，獲得表面 固定有靶向引物的基底。
[0038] 靶向引物（與待測核酸片段的部分序列）互補(bǔ)盡可能覆蓋所需待測序基因片段的 長度，穩(wěn)定高效的捕獲靶向DNA片段，比如針對HBV病毒的測序，需要覆蓋所有的基因突變 點(diǎn)和耐藥位點(diǎn)。靶向引物一般固定在光學(xué)透明的經(jīng)過修飾的基底上面。基底表面需要經(jīng)過 化學(xué)修飾以便于靶向引物通過化學(xué)鍵或者物理吸附作用固定在基底表面。基底為具有低的 天然熒光或基本上不發(fā)熒光的任何合適的載體。
[0039] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的基底可以是二維或三維的，并且可以包 括一個平坦表面（例如，玻璃載玻片），或者可以是其他形狀。本發(fā)明的基底可以包括玻璃 (例如，可控孔度玻璃（CPG))，石英，塑料（如聚苯乙烯，不限于低交聯(lián)和高交聯(lián)的聚苯乙 ?。?，聚碳酸酯，聚丙稀和聚methymethacrylate，丙稀酸共聚物，聚酰胺，娃，金屬（例如， alkanethiolate-衍生金），纖維素，尼龍，乳膠，葡聚糖，凝膠基質(zhì)（例如，硅膠），聚丙烯醛， 或復(fù)合材料。
[0040] 合適的三維基底包括，例如，球，微粒，珠，膜，載玻片，平板，微機(jī)械加工的芯片，管 (例如，毛細(xì)管），微孔，微流體裝置，通道，過濾器，或任何其它合適用于錨定核酸的結(jié)構(gòu)。 基底可包括具有靶向引物區(qū)域的平面陣列或矩陣，比如包括核苷衍生的CPG和聚苯乙烯基 底片；衍生的磁基底片等。
[0041] 靶向引物通過行業(yè)內(nèi)常規(guī)的化學(xué)鍵或者物理吸附作用固定在基底表面，可以直接 或間接（如通過生物素）固定在基底表面。在一個具體實(shí)施方案中，我們使用的是經(jīng)環(huán)氧 硅烷處理的低熒光玻璃表面，其表面的環(huán)氧鍵可以和靶向引物末端的氨基進(jìn)行化學(xué)鍵合。
[0042] 如圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例對靶向引物進(jìn)行固定的原理圖。圖2包括a-b，圖2包 括a-b，a為在環(huán)氧基玻片上固定祀向引物DNA示意圖，b為在修飾有其他基團(tuán)的玻片上固 定靶向引物的反應(yīng)流程示意圖。該技術(shù)利用了環(huán)氧基團(tuán)本身不穩(wěn)定，張力較大，能和修飾 有_順 2的DNA發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，通過新的-CH2-NH-這個共價鍵將待固定的DNA單鏈固 定在修飾有環(huán)氧基團(tuán)的芯片表面。該固定技術(shù)僅是本發(fā)明的一種具體實(shí)施例，本發(fā)明方法 的優(yōu)化對所有的固定載體和DNA序列均有效。DNA序列5'端連有可以和芯片發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 的基團(tuán)，如氨基、醛基、羧基、巰基等；3'端用單分子熒光物質(zhì)修飾，如Cy3、Cy5,目的在于統(tǒng) 計固定的數(shù)目，便于考察靶向引物的固定效果。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，靶向引物分子的5'連接聚胸腺嘌呤核苷酸（聚dT)的寡核酸 鏈的3端，聚dT寡核酸鏈的5'通過氨基與基底表面的環(huán)氧基鍵合。在一個優(yōu)選的實(shí)施方 案中，靶向引物分子的5'順次連接有聚胸腺嘌呤核苷酸（聚dT)的寡核酸鏈和烷基鏈（比 如，-(CH2)n-的烷基鏈，其中，n為自然數(shù)，優(yōu)選為-(CH2) 6-的烷基鏈），其中，聚dT寡核酸鏈 的3'端與靶向引物分子的5'相連，聚dT寡核酸鏈的5端與烷基鏈相連，烷基鏈通過氨基 與基底表面的環(huán)氧鍵鍵合。
[0044] 固定好的引物密度要求為在保證單分子級別的分散度上，盡可能的密度高一些， 這樣可以保證盡可能高的測序通量。在一實(shí)施方案中，基底可以采用行業(yè)內(nèi)其他處理方式， 以改善核酸附著效率。在其他實(shí)施方案中，可以對本發(fā)明中使用的基片進(jìn)行處理，以降低背 景噪音。用于對基底進(jìn)行修飾的環(huán)氧化物還可以為環(huán)氧化物的衍生物。
[0045] 在一些實(shí)施方案中，步驟（1)中，所述固定液為0? 02~0? 3M的K2HP04溶液。
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