中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0209] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0210] 實施例1、與東亞人群2型糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病合并冠 心病和糖尿病治療藥物耐藥性相關(guān)的SNP位點組合及其擴增引物和探針的設(shè)計
[0211] -、與東亞人群2型糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病合并冠心病 和糖尿病治療藥物耐藥性相關(guān)的SNP位點組合的篩選
[0212] 在PubMed、mtSNP、中國期刊網(wǎng)和重慶維普等數(shù)據(jù)庫中分別檢索并下載與東亞人群 2型糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病合并冠心病易感性相關(guān)SNP位點，及與 瑞格列奈、羅格列酮、二甲雙胍和格列齊特耐藥性相關(guān)SNP位點文獻(xiàn)，從所下載的文獻(xiàn)中分 別摘錄能顯著增加2型糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病合并冠心病患病風(fēng) 險的SNP位點等位基因及與糖尿病治療藥物耐藥性相關(guān)的SNP位點。
[0213] 本發(fā)明篩選出與東亞人群的2型糖尿病易感SNP位點組合如表1所示、糖尿病腎 病易感SNP位點組合如表2所示、糖尿病視網(wǎng)膜病變易感SNP位點組合如表3所示、糖尿病 合并冠心病易感SNP位點組合如表4所示、糖尿病治療藥物（瑞格列奈、羅格列酮、二甲雙 胍和格列齊特）耐藥性相關(guān)SNP位點組合如表5所示。
[0214] 表1、2型糖尿病易感SNP位點組合
[0215]
[0216]
[0219] 表3、糖尿病視網(wǎng)膜病變易感SNP位點組合
[0220]
[0224] 表5、降糖藥物耐藥性相關(guān)的SNP位點組合
[0225]
[0226]
[0227] 二、針對SNP位點組合的擴增引物和單堿基延伸引物的設(shè)計
[0228] 利用Sequenom官方網(wǎng)站上引物設(shè)計軟件分別設(shè)計擴增包含實施例1中得到的SNP 位點的擴增引物和單堿基延伸引物。引物設(shè)計的靈敏度要求：在DNA模板量低至10ng的反 應(yīng)體系中可以得到目的片段；引物設(shè)計的準(zhǔn)確性要求：準(zhǔn)確度要求大于99. 7 %。針對實施 例1中得到的SNP位點設(shè)計的擴增引物和單堿基延伸引物序列如表6和表7所示：
[0229] 表6、針對SNP位點設(shè)計的擴增引物序列
[0230]
[0231]
[0232]
[0235]

[0236] 上述擴增引物分配方式如下：47個SNP位點對應(yīng)的擴增引物隨機分配到5個不同 的反應(yīng)孔（wOl、w02、w03、w04和w05)中，不同rs號的SNP位點對應(yīng)的擴增引物所在的反 應(yīng)孔如下表8所示。當(dāng)每個反應(yīng)孔中含有的擴增引物確定之后，Sequenom平臺會自動計算 出該反應(yīng)孔中各條引物的最合適的終濃度，按照Sequenom平臺自動計算出終濃度進(jìn)行操 作即可。
[0237] 表8、不同rs號對應(yīng)的擴增引物在不同反應(yīng)孔中的組合
[0238]
[0239] 上述擴增引物和單堿基延伸引物也可以作為檢測如下SNP位點：rsl0229583、 rsl0811661、rsl0886471、rsllll875、rsl2742393、rsl2779790、rsl3266634、rsl535500、 rsl6856187、rsl6861329、rsl801282、rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、 rs5219、rs6017317、rs6467136、rs6815464、rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、 rs7756992、rs780094、rs7903146、rs8050136、rs831571、rs9470794、rs2268388、 rs9565164、rs4668142、rs2380261、rs39059、rsl7756941、rs245955、rs245962、rs266729、 rs3811951、rsl56019、rs6234、rs3856806、rsl0494366、rsll977021、rs2230806、 rsll212617和rs622342的試劑盒組分。
[0240] 實施例2、擴增引物和單堿基延伸引物在檢測與糖尿病相關(guān)的SNP位點中的應(yīng)用
[0241] 1、血液樣本的采集
[0242] 采集3252例糖尿病患者（以上患者來源于上海市第六人民醫(yī)院，所有患者樣本的 DNA序列均經(jīng)測序確認(rèn)并經(jīng)臨床診斷，患者知情）和3359例正常的人的血液。
[0243] 2、DNA的提取
[0244] 分別提取步驟1獲得的待測血液樣本的DNA，具體步驟如下：在加入蛋白酶K的 1. 5ml離心管中依次加入250y1血液、225y1緩沖液GH，吹吸或振蕩混勻；置于65°C，孵 育lOmin，期間顛倒混勻3次或振蕩混勻；加入20y1磁珠懸浮液G，吹吸或振蕩混勻；加入 325y1異丙醇（可以將磁珠與異丙醇按比例混勻后一起加入），吹吸或振蕩混勻15min;置 于磁力架上靜置30sec，待磁珠完全吸附時小心去除液體，加入700y1漂洗緩沖液I，吹吸 或振蕩混勻，置于磁力架上靜置30sec，待磁珠完全吸附時小心去除液體，加入700y1漂洗 緩沖液II，吹吸或振蕩混勻；置于磁力架上靜置30sec，待磁珠完全吸附時小心去除液體， 離心管于磁力架上，室溫晾干lOmin;將離心管從磁力架上取下，加入65y1洗脫液TB，吹吸 或振蕩混勻，置于56°C，孵育lOmin，期間顛倒混勻3次或振蕩混勻（若使用帶振蕩功能的 恒溫金屬浴也可將轉(zhuǎn)速調(diào)至1500rpm);將離心管放置于磁力架上靜置2min，待磁珠完全吸 附時將DNA溶液轉(zhuǎn)移至收集板，并于-20°C條件保存。
[0245] 3、PCR擴增
[0246] 將步驟2提取的待測血液樣本的DNA進(jìn)行稀釋，并將稀釋后的待測血液樣本分別 加入到384孔板中，進(jìn)行多重PCR擴增。具體如下：
[0247] 將多重PCR擴增的反應(yīng)體系加入每個反應(yīng)孔中，多重PCR擴增的反應(yīng)體系（5ul): 25mMdNTPs0.1ul，10XPCRBuffer0.4ul，25mmol/LMgCl20.4ul，模板DNA10ng，弓丨 物混合液（表8所示的每個反應(yīng)孔中加入的所有SNP位點的擴增引物）0.5uMlul， HotstarTaq(5U/ul)0.lul，補足水到 5ul。
[0248] 反應(yīng)體系配制好后使用膠片膜將384孔板密封，防止樣品蒸發(fā)。將密封后的384 孔板置于ABI9700PCR儀上反應(yīng)：預(yù)變性 94°C2min;94°C20sec，56°C30sec，72°Clmin，45 個循環(huán)；72°C3min;Hold4°C，得到PCR擴增產(chǎn)物。將得到的PCR擴增產(chǎn)物2500rpm離心 lmin〇
[0249] 下述步驟4-步驟8中的試劑均為Sequenom平臺的配套產(chǎn)品，按照Sequenom平臺 的操作步驟即可得到待測樣本的SNP位點分型結(jié)果，具體步驟如下：
[0250] 4、SAP消化反應(yīng)
[0251] 將步驟3得到的PCR擴增產(chǎn)物2000rpm離心lmin后進(jìn)行SAP消化反應(yīng)。具體如 下：
[0252] 按照實際所需加樣量的110%來配制SAP反應(yīng)Mix(2ul):SAPBuffer0.17ul，SAP EnzymeO. 3ul，補足水到 2ul。
[0253] 向上述步驟3處理后的384孔板的每孔中加入上述SAP反應(yīng)Mix2yl/孔，加好后 用排槍吹打5次，用膠片膜將孔封閉，渦旋震蕩30s，使反應(yīng)物充分混勻，2500rpm離心lmin。
[0254] 將384孔板放置在ABI9700PCR儀上，并將反應(yīng)蓋擰緊，設(shè)定SAP消化反應(yīng)程序： 37°C40min，85°C5min，Hold4°C，得到SAP消化反應(yīng)產(chǎn)物。將得到的SAP消化反應(yīng)產(chǎn)物 2500rpm離心lmin。
[0255] 5、單堿基延伸反應(yīng)
[0256] 將步驟4得到的SAP消化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。具體如下：
[0257] 按照實際所需加樣量的120%來配制延伸Mix:iPLEXBufferplus0.2ul，iPLEX TerminatorO. 2ul，iPLEXEnzyme0? 041ul，引物Mix(表8中所不的每個反應(yīng)孔對應(yīng)的所有 SNP位點對應(yīng)的單堿基延伸引物）lul，補足水到2. 06ul。
[0258] 將延伸Mix用排槍加入到上述步驟4處理后的384孔板中，加入量為2. 06y1/ 孔，加入后使用排槍吹打5次，使反應(yīng)物充分混勻。用膠片膜將孔封閉，然后2000rpm離心 lmin。將384孔板放置在ABI9700PCR儀中，扣緊加熱蓋，打開PCR儀，設(shè)置延伸反應(yīng)程序， 反應(yīng)程序如表9所示，得到單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物。將得到的單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物2500rpm 離心lmin〇
[0259]表9、單堿基延伸反應(yīng)程序
[0260]
[0261] 6、樹脂純化
[0262] 將步驟6得到的單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物3000rpm離心2min，每孔加16y1MBG水， 然后用膠片膜將384孔板封閉，3000rpm離心lmin;取一張干凈的A4紙，將6mg板置于其 上，用小勺取適量resin置于384反應(yīng)板上，用塑料蓋板反復(fù)左右推平resin，壓實，使每孔 resin含量均勻；將離心后的384孔板倒置在6mg板上，使兩塊板的孔--對應(yīng)。6mg板在 上，384反應(yīng)板在下。均勻輕輕敲打6mg板背面，使resin落入裝有單堿基延伸產(chǎn)物的384 孔中；使用膠片膜將裝有單堿基延伸產(chǎn)物和resin的384孔板密封，使用搖床低速垂直旋轉(zhuǎn) 30min，使resin與反應(yīng)物充分接觸；3000rpm離心3min使resin沉入管底，得到樹脂純化 后的延伸產(chǎn)物。
[0263] 7、芯片點樣
[0264] 啟動MassARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀，將步驟6得到的樹脂純化后的延 伸產(chǎn)物點至384點陣SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，得到點樣后的SpectroCHIP芯片。
[0265] 8、質(zhì)譜檢測
[0266]將步驟 7 得到的點樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization-timeoffligh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì) 譜）分析，檢測結(jié)果使用TYPER4. 0軟件（Sequenom)分型并輸出結(jié)果。
[0267] 9、檢測結(jié)果
[0268] 檢測結(jié)果表明：所有待測樣本的47個SNP位點的分型結(jié)果均與其DNA測序結(jié)果 一致，其中，某一個待測樣本（待測樣本中的1例糖尿病患者）的SNP位點分型結(jié)果如表 10所示。說明本發(fā)明的擴增引物和單堿基延伸引物可以有效的用于檢測如下SNP位點： rsl0229583、rsl0811661、rsl0886471、rsllll875、rsl2742393、rsl2779790、rsl3266634、 rsl535500、rsl6856187、rsl6861329、rsl801282、rs2237892、rs340874、rs3786897、 rs4430796、rs5219、rs6017317、rs6467136、rs6815464、rs7041847、rs7172432、rs7612463、 rs7651090、rs7756992、rs780094、rs7903146、rs8050136、rs831571、rs9470794、 rs2268388、rs9565164、rs4668142、rs2380261、rs39059、rsl7756941、rs245955、rs245962、 rs266729、rs3811951、rsl56019、rs6234、rs3856806、rsl0494366、rsll977021、rs2230806、 rsll212617和rs622342。
[0269] 表10、SNP位點分型結(jié)果
[0270]

【主權(quán)項】
1?一種用于檢測如下 SNP 位點：rsl0229583、rsl0811661、rsl0886471、rsllll875、 rsl2742393、rsl2779790、rsl3266634、rsl535500、rsl6856187、rsl6861329、rsl801282、 rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、rs6017317、rs6467136、rs6815464、 rs7041847、 rs7172432、 rs7612463、