一種單分子靶向測(cè)序方法、裝置、系統(tǒng)及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種單分子靶向測(cè)序方法、裝置、系統(tǒng)及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 二代測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用在很多領(lǐng)域，但其內(nèi)在缺陷帶來(lái)諸如起始樣品量大，測(cè)序 時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高，PCR擴(kuò)增過(guò)程帶來(lái)的測(cè)序錯(cuò)誤等開(kāi)始凸顯。以直接針對(duì)單個(gè)DNA分子的測(cè) 序技術(shù)（SMS)為特征的新三代測(cè)序技術(shù)則針對(duì)解決二代技術(shù)的缺陷應(yīng)運(yùn)而生，并越來(lái)越多 的引起人們的關(guān)注。
[0003] 世界上首個(gè)基于單分子測(cè)序技術(shù)（tSMS)的測(cè)序儀是由Helicos公司于2008年推 向市場(chǎng)的。其原理是通過(guò)檢測(cè)單個(gè)堿基熒光信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序。具體而言，在測(cè)序 前，待測(cè)DNA被打斷成約200bp的片段，并需要在片段3'末端加上40bp帶有熒光標(biāo)記的 poly(A)尾，文庫(kù)退火形成單鏈，與芯片上固定的OligodT(40bp)探針結(jié)合。Helicos公司 在2012年發(fā)表的學(xué)術(shù)論文則進(jìn)一步改進(jìn)了此項(xiàng)技術(shù)，把待測(cè)的帶焚光，但無(wú)polyA尾修飾 的單個(gè)DNA分子雜交捕獲在特定的探針上面進(jìn)行直接測(cè)序。其結(jié)果顯示出此項(xiàng)技術(shù)潛在的 應(yīng)用前景，尤其是臨床應(yīng)用領(lǐng)域。但Helicos公司發(fā)布的產(chǎn)品由于其高昂的價(jià)格和不穩(wěn)定 性等特點(diǎn)，沒(méi)有得到市場(chǎng)的認(rèn)可，于2011年底破產(chǎn)。
[0004] 此外，太平洋生物公司的單分子測(cè)序儀（SMRT)具有讀長(zhǎng)長(zhǎng)等特點(diǎn)，但是受物理原 件和制作工藝的局限，該儀器通量不高，試劑昂貴，尚未真正應(yīng)用到臨床。因此，利用單分子 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)以及臨床需求而開(kāi)發(fā)的單分子靶向測(cè)序技術(shù)（SMTS)，有望成為應(yīng)用于遺傳病檢 測(cè)和精準(zhǔn)醫(yī)療市場(chǎng)新一代測(cè)序儀器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種單分子靶向測(cè)序方法、裝置、系統(tǒng)及應(yīng)用。本發(fā)明提供 的單分子靶向測(cè)序方法、裝置、系統(tǒng)用于對(duì)任何一條或多條DNA、RNA、mRNA、染色體、基因組、 或其他核酸序列進(jìn)行快速和準(zhǔn)確地測(cè)序。
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供了一種單分子靶向測(cè)序方法，包括：
[0007] ⑴將靶向引物的5'端連接到基底表面；
[0008] (ii)將末端修飾有光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記的模板核酸與所述步驟（i)中連接到基底表面 上的靶向引物進(jìn)行雜交，形成雜交的靶向引物/模板核酸復(fù)合物；
[0009] (iii)對(duì)所述靶向引物/模板核酸復(fù)合物進(jìn)行成像；
[0010] (iv)將所述靶向引物/模板核酸復(fù)合物、聚合酶以及一種或多種帶光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記 的核苷酸混合，通過(guò)聚合酶反應(yīng)將一種或多種帶光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸添加至靶向引物鏈 的3'端；獲得延伸產(chǎn)物；
[0011](V)對(duì)延伸后的靶向引物/模板核酸復(fù)合物進(jìn)行成像，并結(jié)合步驟（iii)中靶向引 物/模板核酸復(fù)合物的定位結(jié)果，進(jìn)行圖像比對(duì)和糾偏，以鑒定模板核酸上的待測(cè)核苷酸 序列；
[0012] (vi)除去延伸產(chǎn)物上帶光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸的可斷裂的基團(tuán)：
[0013] (vii)重復(fù)步驟（iii)至（vi) -次或多次以鑒定所述模板核酸中的1個(gè)或多個(gè)核 苷酸。
[0014] 本發(fā)明通過(guò)延伸反應(yīng)、成像檢測(cè)和切除光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記分子的反復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)SMTS 實(shí)時(shí)測(cè)序。
[0015] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（i)中，革巴向引物為5'端具有10-30bp的polyT 的引物序列，其中，所述引物序列為與模板核酸的至少部分序列互補(bǔ)的序列。
[0016] 在該實(shí)施例中，靶向引物為5'端連接到基底表面的方式為：p〇lyT的5'端連接到 基底表面。
[0017] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（i)中，靶向引物為與模板核酸的至少部分序列 互補(bǔ)的序列。
[0018] 在該實(shí)施例中，靶向引物為5'端連接到基底表面的方式為：p〇lyT的5'端連接到 基底表面。
[0019] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟⑴中，靶向引物為5'端順次連接有10_30bp的 P〇lyT以及烷基鏈的引物序列，其中，所述引物序列為與模板核酸的至少部分序列互補(bǔ)的序 列。
[0020]優(yōu)選地，所述烷基鏈為_(kāi) (CH2) n_(優(yōu)選為-(CH2)6_)，其中，n為自然數(shù)。
[0021] 在該實(shí)施例中，靶向引物為5'端連接到基底表面的方式為：-(CH2)6-通過(guò)氨基與 基底表面的環(huán)氧基連接。
[0022] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，靶向引物為通過(guò)5'端修飾的氨基連接到表面修飾有環(huán)氧基 基底（包括但不限于玻璃基底、石英基底等）。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，將帶有光學(xué)檢測(cè) 標(biāo)記的靶向引物的5'端連接到基底表面的步驟包括：
[0023]a)將環(huán)氧基修飾的玻璃基底浸泡在含0. 4-3. 2nM靶向引物的固定液中（優(yōu)選 45min-120min);清洗基底；
[0024]b)將基底浸入磷酸鹽鈍化液中，搖晃（優(yōu)選10-15小時(shí)）；清洗基底，獲得所述表 面固定有靶向引物的基底。
[0025] 在該優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟a中，所述固定液為0. 02-0. 311的1(2即04 溶液。
[0026] 在該優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟a中，所述固定液中革巴向引物的濃度優(yōu) 選為0. 8-3. 2nM，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 8-1. 6nM。
[0027] 在該優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟a中，采用3xSSC+0. 1%Triton, 3x SSC, 150mM K2HP04pH=8. 5清洗基底。
[0028] 在該優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟b中，搖晃的條件為置于搖床上搖晃 (優(yōu)選為40-80轉(zhuǎn)/分鐘）。
[0029] 在該優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟b中，磷酸鹽鈍化液為pH= 9. 0， 0. 2-1M(優(yōu)選 0. 2-0. 8M)K2HP04溶液。
[0030] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述模板核酸的3'端和/或5'端帶有光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記。
[0031] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
[0032] 優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)記物選自熒光素，羅丹明，花青，Cy5, Cy3中的一種或多種。
[0033] 在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，帶有熒光標(biāo)記的核苷酸為單色可逆末端終止子。
[0034] 在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，帶有熒光標(biāo)記的核苷酸為多色可逆末端終止子。
[0035] 如本發(fā)明所述的，單色可逆末端終止子為A、T、C、G中的任一種均帶有相同的熒光 標(biāo)記；每次循環(huán)只添加一種核苷酸。
[0036] 如本發(fā)明所述的，多色可逆末端終止子為A、T、C、G各自帶有互不相同的熒光標(biāo) 記，每次循環(huán)可同時(shí)添加多種核苷酸，并通過(guò)對(duì)不同的熒光標(biāo)記分別讀取各核苷酸的熒光 fg息。
[0037] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（iii)中，對(duì)所述靶向引物/模板核酸復(fù)合物進(jìn)行 成像的步驟包括：
[0038] 在每個(gè)延伸循環(huán)反應(yīng)中，對(duì)同一位點(diǎn)的靶向引物/模板核酸復(fù)合物在延伸反應(yīng)前 后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行成像。
[0039] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，步驟（iv)的延伸反應(yīng)之前的步驟（iii)中，通過(guò)全內(nèi)反射 顯微鏡（TIRF)采集光學(xué)圖像來(lái)精確定位靶向引物/模板核酸復(fù)合物所處的位置。
[0040] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述的聚合酶選自逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶或DNA聚合酶。
[0041] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，步驟（iv)還包括對(duì)獲得的延伸產(chǎn)物進(jìn)行清洗。在本發(fā)明一 實(shí)施例中，步驟（vi)中，所述核苷酸的可斷裂的基團(tuán)為光可裂解的終止基團(tuán)、化學(xué)斷裂的 終止基團(tuán)或酶催化斷裂的終止基團(tuán)。
[0042] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，步驟（vi)還包括對(duì)除去光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記處理后的延伸產(chǎn)物 進(jìn)行清洗。
[0043] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，還包括同步地對(duì)多個(gè)靶核酸測(cè)序。
[0044] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（V)中，所述的對(duì)延伸后的靶向引物/模板核酸復(fù) 合物進(jìn)行成像的步驟包括：
[0045] 在延伸反應(yīng)后的同一時(shí)間點(diǎn)，對(duì)靶向引物/模板核酸復(fù)合物中的模板核酸、以及 在該延伸反應(yīng)中結(jié)合到靶向引物鏈3'端的帶光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行成像。
[0046] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述（v)的步驟包括：通過(guò)全內(nèi)反射顯微鏡（TIRF)采集光 學(xué)圖像來(lái)鑒定步驟（iv)引入的核苷酸種類。
[0047] 本發(fā)明提供的單分子靶向測(cè)序方法中的圖像采集步驟優(yōu)選采用全內(nèi)反射顯微系 統(tǒng)（TIRF)，提升信噪比。本發(fā)明提供的方法在每次步驟（iv)的延伸反應(yīng)之后分別對(duì)模板核 酸和帶熒光標(biāo)記的核苷酸拍照；通過(guò)對(duì)同一個(gè)坐標(biāo)視野的前后兩次成像，糾正進(jìn)行拍照時(shí)， 由于載物臺(tái)的輕微移動(dòng)或樣品漂移產(chǎn)生的些許偏差。
[0048] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（V)中，所述的進(jìn)行圖像比對(duì)和糾偏的步驟包括：
[0049] 對(duì)同一位點(diǎn)的靶向引物/模板核酸復(fù)合物在延伸反應(yīng)前后不同時(shí)間點(diǎn)的成像進(jìn) 行圖像比對(duì)和糾偏；以及
[0050] 對(duì)該位