檢測人類idh1基因突變的方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測基因突變的方法及其試劑盒，特別涉及一種檢測人類IDH1 基因突變的方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內(nèi)原 發(fā)腫瘤的一半，廣義上是指所有神經(jīng)上皮來源的腫瘤，狹義上則是指源于各類膠質(zhì)細胞的 腫瘤。通用WHO分級根據(jù)非典型性、核分裂指數(shù)、內(nèi)皮細胞增殖和壞死程度分為4級：1級： 以良性毛細胞型星形細胞瘤為主，占膠質(zhì)瘤5%左右，通?？梢灾斡?；II級：為一般的星形 細胞瘤或混合性少突星形細胞瘤，占膠質(zhì)瘤的30~40%左右；III級：為間變型星形細胞 瘤，占膠質(zhì)瘤的15~25%左右，一般由II級演變而來；IV級：為膠質(zhì)母細胞瘤，占膠質(zhì)瘤的 1/3左右。低級別的膠質(zhì)瘤在臨床上主要是指WHO分類為星形細胞瘤I與II級，也包括少 突膠質(zhì)細胞瘤及混合性少突星形細胞瘤。
[0003] 異檸檬酸脫氫酶（IDH)家族包括以NAD或NADP為輔助因子，催化異檸檬酸的氧化 脫羧反應(yīng)生成a-酮戊二酸的酶類，同時分別生成NADH或NADPH。在哺乳動物細胞中，IDH 同工酶有以下三種形式：依賴NAD的線粒體IDH1，依賴NADP的線粒體IDH2,依賴NADP的胞 質(zhì)IDH3。編碼依賴NAD的人IDH1的IDH1基因位于染色體2q33. 3,并且定位于細胞質(zhì)和 過氧化物酶體中；編碼依賴NADP的線粒體IDH2酶的IDH2基因位于染色體15q26. 1。盡管 IDH1和IDH2都參與了細胞內(nèi)氧化損傷的防御機制，但IDH1在脂質(zhì)的代謝機制中也發(fā)揮了 重要作用。
[0004] 大量研究證實，代謝的異常是引發(fā)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的因素之一。IDH基因突變發(fā)生 在腫瘤的早期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的IDH基因高度保持一致。一般認為，IDH基因狀態(tài)不 會因治療而發(fā)生變化。IDH基因在多種腫瘤中發(fā)生了突變，其發(fā)生率在結(jié)直腸癌約為40%， 胰腺癌為90%以上，肺癌約為15%。IDH1基因突變主要集中發(fā)生在第2外顯子的12和13 密碼子R>H(彡90% )稱為R132H，這些突變破壞了IDH1蛋白內(nèi)在的GTPase活性，從而使 得IDH1蛋白處于持續(xù)活性狀態(tài)。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN)臨床實踐指南（第二版， 2014)將有無IDH1/2基因突變作為評估低級別膠質(zhì)瘤患者風險級別的指標之一。
[0005] 以往膠質(zhì)瘤診斷及其分級主要依賴組織病理學，但僅靠組織形態(tài)學，特別是立體 定向取材小標本，使組織缺乏典型病變，常常不能根據(jù)腫瘤的密度、異型性、血管增生、壞死 等進行分級。當取材為腫瘤（尤其低級別膠質(zhì)瘤）邊緣時，或腫瘤治療后判斷是否存在復 發(fā)情況時，區(qū)分這些膠質(zhì)細胞是腫瘤還是反應(yīng)性增生就顯得十分困難。而直接測序法檢測 基因突變則存在步驟繁瑣、工序復雜、費時費力的不足。
[0006] 擴增阻礙突變系統(tǒng)（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)于 1989 年建立，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設(shè)計突變特異性ARMS引物，其3'末端堿 基與待檢測突變型的突變堿基匹配，用于特異性擴增突變模板。ARMS的檢測靈敏度依賴于 ARMS引物的特異性和反應(yīng)條件如酶、鎂離子濃度等的優(yōu)化。為了增加引物的特異性，減少引 物與靶DNA發(fā)生錯配時的錯配延伸，可通過在引物3'端的第2-3個堿基引入另外一個或者 兩個錯配堿基，使之與模板之間形成多重錯配以阻止錯誤延伸。相比于組織病理學診斷方 法，應(yīng)用ARMS將顯著提高IDH1基因突變檢測的效率、靈敏度及特異性。
[0007] 熒光定量PCR方法是分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，該方法靈敏度高、可實 時定量，是適合臨床大規(guī)模使用的方法。IDH1基因序列中GC含量很高，因此片段擴增的難 度很大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，同時實現(xiàn)對人類IDH1基因突變的檢測并計算 樣本的突變率，從而為腫瘤預后判斷、靶向用藥提供參考，本發(fā)明提供了一種檢測人類IDH1 基因突變的方法及其試劑盒，該檢測方法和應(yīng)用該方法的試劑盒將特異性引物用于熒光定 量PCR方法中，可以克服IDH1基因序列GC含量高、難以擴增等不利條件影響，對R132H位 點突變實現(xiàn)有效的鑒別，檢測靈敏度達到1%。
[0009] -種檢測人類IDH1基因突變的熒光定量PCR方法，包括以下步驟：
[0010] (1)在IDH1R132H反應(yīng)混合液中加入從樣品中提取的、作為模板的人類基因組DNA，形成R132H反應(yīng)體系并進行熒光定量PCR擴增，還在IDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中加入從 同一樣品中提取的、作為模板的人類基因組DNA，形成內(nèi)標反應(yīng)體系并進行熒光定量PCR擴 增，其中：
[0011] 所述IDH1R132H反應(yīng)混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 1所示序列的 IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有 熒光染料的PCR預混液；
[0012] 所述IDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的IDH1 內(nèi)標如向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 4所不序列的IDH1內(nèi)標反向引物和含有焚光染 料的PCR預混液；
[0013] (2)結(jié)果判斷：首先確定人類基因組DNA在R132H反應(yīng)體系進行熒光定量PCR擴 增時的突變ct值，然后確定同一樣本在內(nèi)標反應(yīng)體系的ct值，對ct值進行分析。
[0014] -種檢測人類IDH1基因突變的熒光定量PCR方法，其中：
[0015] 所述在IDH1R132H反應(yīng)混合液中加入從樣品中提取的、作為模板的人類基因 組DNA為：在10yLIDH1R132H反應(yīng)混合液中加入5yL、濃度為10ng/yL的人類基因組 DNA，其中：在IDH1R132H反應(yīng)混合液中IDH1R132H前向引物、IDH1R132H反向引物和含有 熒光染料的2XPCR預混液的體積比為（1-2) : (1-2) : (7-8)，優(yōu)選為1.25:1. 25:7. 5;在 IDH1R132H反應(yīng)混合液中IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物的濃度均為2-6yM， 優(yōu)選4-5yM，更優(yōu)選4. 8yM;
[0016] 所述在IDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中加入從同一樣品中提取的、作為模板的人類基因 組DNA為：在14yLIDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中加入lyL、濃度為10ng/yL的從同一樣品 中提取的人類基因組DNA，其中：每14yLIDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中有IDH1內(nèi)標前向引物 0. 3-0. 5yL、IDH1內(nèi)標反向引物0. 3-0. 5yL和含有熒光染料的2XPCR預混液7-8yL， 不足14yL的體積用水或緩沖液補足，優(yōu)選的每14yLIDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中有IDH1內(nèi) 標前向引物〇. 3125yL、IDH1內(nèi)標反向引物0. 3125yL和含有熒光染料的2XPCR預混液 7. 5yL;在IDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中IDH1內(nèi)標前向引物和IDH1內(nèi)標反向引物的濃度均為 2-6yM，優(yōu)選 4-5yM，更優(yōu)選 4. 8yM。
[0017] -種檢測人類IDH1基因突變的熒光定量PCR方法，其中所述熒光定量PCR方法 的擴增過程為：（1) 95°C、3min、循環(huán)數(shù)為 1 ; (2) 95°C、15s，68°C、20s，循環(huán)數(shù)為 18 ; (3) 95°C、 15s，57. 6°C、20s，循環(huán)數(shù)為 24 ;(4)升溫至 95°C。
[0018] -種檢測人類IDH1基因突變的熒光定量PCR方法，其中所述對Ct值進行分析的 步驟為：
[0019] 當樣品在R132H反應(yīng)體系的突變Ct值大于或等于陰性臨界值19時，則該樣品的 R132H突變?yōu)殛幮曰蛐∮诒驹噭┖械臋z測最低閾值，
[0020] 當樣品在R132H反應(yīng)體系的突變Ct值小于陰性臨界值19時，按照以下標準進行 判斷：當該樣品在R132H反應(yīng)體系的突變Ct值小于或等于陽性臨界值16時，則該樣品的 R132H突變?yōu)殛栃?，即強陽；當該樣品在R132H反應(yīng)體系的突變Ct值大于陽性臨界值16時， 則計算R132H反應(yīng)體系的ACt，ACt值=R132H反應(yīng)體系突變Ct值-該樣本在內(nèi)標反應(yīng) 體系的Ct值，若反應(yīng)體系的ACt值小于相應(yīng)的ACtCut-off值9,則該樣品的R132H突 變也為陽性，即弱陽，若反應(yīng)體系的ACt值大于或等于相應(yīng)的ACtCut-off值9,則該樣品 的R132H突變?yōu)殛幮曰虻陀诒驹噭┖械臋z測最低閾值。
[0021] -種檢測人類IDH1基因突變的試劑盒，包括IDH1R132H反應(yīng)混合液，還包括IDH1 內(nèi)標反應(yīng)混合液，其中：
[0022] 所述IDH1R132H反應(yīng)混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 1所示序列的 IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有 熒光染料的PCR預混液；
[0023] 所述IDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的IDH1 內(nèi)標如向引物、具有如序列表中SEQIDNo. 4所不序列的IDH1內(nèi)標反向引物和含有焚光染 料的PCR預混液。
[0024] IDH1基因突變上、下游引物序列
[0025]
[0026] 一種檢測人類IDH1基因突變的試劑盒，其中所述IDH1R132H前向引物、IDH1R132H 反向引物和含有熒光染料的2XPCR預混液在IDH1R132H反應(yīng)混合液中的體積比為（1-2): (1-2) :(7-8)，優(yōu)選為 1. 25 :1. 25 :7. 5 ;IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物在 IDH1R132H反應(yīng)混合液中的濃度均為2-6yM，優(yōu)選4-5yM，更優(yōu)選4. 8yM。
[0027] -種檢測人類IDH1基因突變的試劑盒，其中所述IDH1內(nèi)標前向引物、IDH1內(nèi)標反 向引物和含有熒光染料的2XPCR預混液在IDH1內(nèi)標反應(yīng)混合液中的體積比為（0. 3-0. 5): (0.3-0.5) :(7-8)，優(yōu)選為0.3125 :0.3125 :7.5