一種快速檢測(cè)母豬胚胎存活的miRNA分子標(biāo)志miR-145及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于快速檢測(cè)母豬胚胎存活的miRNA 分子標(biāo)記miR-145、miR-145的引物、試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 提尚母豬廣仔數(shù)可以提尚母豬繁殖性能，進(jìn)而有效提尚養(yǎng)豬企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。胚 胎存活率是影響母豬產(chǎn)仔數(shù)的重要因素之一。在養(yǎng)豬生產(chǎn)，如何盡早淘汰胚胎存活差的母 豬，成為了困擾生產(chǎn)者的一道難題。目前在生產(chǎn)中淘汰胚胎存活差母豬的方法主要通過(guò)觀 察母豬21天返情率和流產(chǎn)率實(shí)現(xiàn)。這種方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還會(huì)造成大量飼料和人力成本 的浪費(fèi)，給養(yǎng)豬生產(chǎn)的利益造成損失。因此我們亟需建立一種能在配種前快速檢測(cè)母豬胚 胎存活的方法。這將大大節(jié)約豬場(chǎng)生產(chǎn)成本，提高其經(jīng)濟(jì)效益。
[0003] 母豬在懷孕期間胚胎和胎兒的損失大約30%~50%，其中超過(guò)75%的損失發(fā)生 在配種后的前25d(即胚胎附植期）。研究發(fā)現(xiàn)圍植入期子宮內(nèi)膜發(fā)育不良是導(dǎo)致母豬懷孕 后前30d胚胎損失的一個(gè)關(guān)鍵因素。miRNAs是一類長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸非編碼小RNA， 在進(jìn)化過(guò)程中高度保守、并在各組織細(xì)胞中特異性表達(dá)。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)miRNAs通過(guò)轉(zhuǎn) 錄后調(diào)控基因表達(dá)參與多種生物學(xué)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，在很多與子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)生和 發(fā)展過(guò)程中扮演極其重要角色，可以用來(lái)預(yù)測(cè)不孕、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位等的分子標(biāo) 志物。越來(lái)越多研究證據(jù)已經(jīng)表明miRNA作為一種調(diào)控因子在調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育和胚胎存 活等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究結(jié)果表明，血清中miRNA分子是由組織中的miRNA主動(dòng) 分泌而獲得的，因此通過(guò)分析胚胎存活差母豬子宮內(nèi)膜組織miRNA的表達(dá)譜，然后在血清 中篩選差異表達(dá)的miRNA，將會(huì)是一種尋找母豬胚胎存活分子標(biāo)記物行之有效的辦法。
[0004] 因此本發(fā)明根據(jù)上述思路開(kāi)發(fā)了一種miRNA分子作為快速檢測(cè)母豬胚胎存活的 分子標(biāo)志物，通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)微量血清樣品中這種分子標(biāo)志物的表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)母 豬胚胎存活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)上述存在的問(wèn)題作出改進(jìn)，提出一種用于快速檢測(cè)母豬胚胎存活的 miRNA分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明通過(guò)microRNA基因芯片從胚胎存活數(shù)少的母豬子宮內(nèi)膜中篩選出異常高 表達(dá)的microRNA，并通過(guò)realtimePCR驗(yàn)證，最終明確miR-145與胚胎存活高度相關(guān)，可以 作為快速檢測(cè)胚胎存活的標(biāo)記物。
[0008] 因?yàn)榕咛ゴ婊顢?shù)少母豬子宮內(nèi)膜中異常高表達(dá)的miR-145可以通過(guò)組織的主動(dòng) 分泌過(guò)程分泌到血清中，所以本發(fā)明重點(diǎn)分析了胚胎存活數(shù)少母豬血清miR-145的成熟體 (其序列為5' -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU-3'，如SEQIDN0:1所示）的表達(dá)情況，首次 發(fā)現(xiàn)血清miR-145可以作為快速檢測(cè)母豬胚胎存活分子標(biāo)志物進(jìn)行應(yīng)用。具體應(yīng)用時(shí)，在 母豬配種前半小時(shí)采集血樣，采用RealtimePCR檢測(cè)血清中miR-145的表達(dá)水平。若能檢 出，則該母豬應(yīng)該被淘汰。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)母豬胚胎存活的miRNA分子標(biāo) 記miR-145,所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQIDNO: 1所示，所述miRNA分子標(biāo)記 物在胚胎存活數(shù)少母豬子宮內(nèi)膜組織中異常高表達(dá)，并通過(guò)組織的主動(dòng)分泌過(guò)程分泌到血 清中；分泌至血清中的核苷酸分子標(biāo)記miR-145用于母豬胚胎存活的快速檢測(cè)。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)所述分子標(biāo)記miR-145引物對(duì)，其特 征在于：核苷酸序列如下：
[0011]前向引物：5' -GTCCAGmTCCCAGGAATCCCTTA-3'，如SEQIDN0. 2 所示；
[0012] 逆向引物序列為通用的適配子引物。
[0013] 所述引物對(duì)特異性擴(kuò)增出SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于快速檢測(cè)母豬胚胎存活的試劑盒，包 括上述的引物對(duì)。
[0015] 所述的試劑盒，還包括2. 5U/y1PolyA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、去 RNA酶水、2XqPCR混合液、70 %乙醇、血清裂解液、氯仿和無(wú)水乙醇。
[0016] 所述試劑盒的具體組成如下：
[0017] 2. 5U/y1PolyA聚合酶 20y1;
[0018] 逆轉(zhuǎn)錄酶20yl;
[0019] 5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液100y1 ;
[0020] 去RNA酶水 1000y1 ;
[0021] 2XqPCR混合液 2000y1 ;
[0022] 50um上游特異引物20y1 ;
[0023] 50um下游適配引物20y1;
[0024] 內(nèi)參上游引物20yl;
[0025] 內(nèi)參下游引物20yl;
[0026] 血清裂解液100ml ;
[0027] 70 % 乙醇 100ml;
[0028]氯仿100ml ;
[0029] 無(wú)水乙醇100ml。
[0030] 采用上述試劑盒檢測(cè)miR-145的具體方法為：
[0031] (l)microRNA的提取：
[0032] ①取母豬的外周血血清400y1，加入750y1裂解液MRL，吹打幾次，劇烈震蕩混 勾，在室溫下孵育5min，小心吸取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNasefree的離心管中。
[0033] ②加lmLTrizol試劑，混勻，室溫下放置10分鐘。4°C12000rpm離心15分鐘。
[0034] ③取上清液到1. 5mL的去RNase的EP管中，加入200y1氯仿，劇烈振蕩混勻30 秒，使水相和有機(jī)相能充分混合，室溫靜置15分鐘，4°C12000rpm冷凍離心10分鐘。
[0035] ④吸取上層水相部分移至另一個(gè)新的去RNase的EP管，加入0.5mL異丙醇，震蕩 混勻后室溫下靜置10分鐘，4°C12000rpm冷凍離心10分鐘。
[0036] ⑤去上清，加入70%乙醇以沉淀RNA成份，并加入適量的DEPC水將其溶解。
[0037] (2)miR_145 的檢測(cè)：
[0038] ①按照得到的RNA+逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5y1+逆轉(zhuǎn)錄酶1y1+2. 5U/y1聚合酶1y1+ 去RNA酶水補(bǔ)足到25y1。
[0039] ②37°C水浴60min ;85°C水浴5min后放于冰上，得到的microRNAcDNA。
[0040]③cDNA2yl+2xqPCR混合液 10y1+ 引物（2yM) 2y1+ 通用引物（2yM) 2y1+DDW 4yl〇
[0041] ④預(yù)變性95°C 5min -(變性30秒一退火60°C 30秒一延伸72°C 30秒）40個(gè)循 環(huán)熔解曲線72°C -95°C 0? 5°C /10秒一冷卻25°C 30秒。
[0042] ⑤根據(jù)得到的Ct值，減去內(nèi)參基因，代入2-A ACT，得到miR-145在該母豬血清中 的表達(dá)值。
[0043] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)血清miR-145成熟體的特異性擴(kuò) 增的方法，其特征在于：包括如下步驟：首先進(jìn)行血清microRNA的抽提，然后在poly(A)聚 合酶在其3'末端加polyA尾，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行RealtimePCR 擴(kuò)增。
[0044] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：
[0045] (1)上述的分子標(biāo)記在預(yù)測(cè)母豬胚胎存活中的應(yīng)用；
[0046] (2)上述的引物對(duì)在預(yù)測(cè)母豬胚胎存活中的應(yīng)用；
[0047] (3)上述的試劑盒在預(yù)測(cè)母豬胚胎存活中的應(yīng)用；
[0048] (4)上述的方法在預(yù)測(cè)母豬胚胎存活中的應(yīng)用。
[0049] 本發(fā)明的有益效果：
[0050] 本發(fā)明利用microRNA基因芯片檢測(cè)和比較胚胎存活數(shù)少和正常對(duì)照的母豬子宮 內(nèi)膜microRNA表達(dá)譜差異，從中篩選出候選microRNA，通過(guò)realtimePCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) miR-145可以作為檢測(cè)母豬胚胎存活的分子標(biāo)記物。異常高表達(dá)的miR-145可以通過(guò)組織 的主動(dòng)分泌過(guò)程分泌到血清中，因此隨后結(jié)合母豬30天受孕情況，大樣本分析了母豬血清 miR-145表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)血清miR-145是一種可以快速檢測(cè)母豬胚胎存活的分子標(biāo)記物。這 種分子標(biāo)記的表達(dá)水平可用來(lái)預(yù)測(cè)母豬胚胎存活，提高母豬產(chǎn)仔數(shù)，提高養(yǎng)豬企業(yè)的經(jīng)濟(jì) 效益。
【附圖說(shuō)明】
[0051] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0052] 圖1為胚胎存活數(shù)少母豬及正常對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織miRNA表達(dá)分析；
[0053] 圖2為胚胎存活數(shù)少母豬及正常對(duì)照組血清miRNA表達(dá)分析。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于 本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0055] 實(shí)施例1芯片法比較胚胎存活數(shù)少母豬子宮內(nèi)膜組織miRNA表達(dá)譜變化差異
[0056] 長(zhǎng)白母豬配種后30天采用獸用B超檢查母豬受孕情況，選擇胚胎附植數(shù)低于8個(gè) 母豬以及相同時(shí)間配種但是胚胎附植位點(diǎn)大于8個(gè)的母豬各5頭進(jìn)行屠宰，取附植位點(diǎn)的 子宮內(nèi)膜樣，-70°C冷凍待測(cè)。
[0057] 按照下述方法提取子宮內(nèi)膜組織中RNA。
[0058] ①液氮研磨子宮內(nèi)膜組織，研磨成粉后轉(zhuǎn)入1.5mLEP管中，按0. lg加入lmL Trizol溶液，顛倒混勾，室溫靜置5min ;
[0059] ②每lmLTrizol加0? 2mL氯仿。蓋緊樣品管蓋，用力搖晃15sec，使其充分混勻， 室溫靜置5min后12000rmp離心15min;
[0060] ③將上層水相轉(zhuǎn)入新的1. 5mLEP管中，加入等體積異丙醇，混勻后放于室溫靜置 lOmin, 12000rmp離心lOmin;
[0061] ④棄上清，將沉淀放置在通風(fēng)處，晾干；
[0062]⑤加入 10y1DEPC水 65°C促溶。
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