miRNA-924在肝硬化診療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種miRNA-924在肝硬化診療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，是各種病因長期作用而形成的彌漫性肝損 害，是多種慢性肝病病情發(fā)展的終末階段，其主要發(fā)病機制是肝星狀細(xì)胞的增殖、活化。肝 硬化起病隱匿，病情發(fā)展緩慢，晚期并發(fā)癥多，預(yù)后差、病死率高。在我國大多數(shù)為肝炎后肝 硬化，少部分為酒精性肝硬化和血吸蟲性肝硬化。
[0003] miRNA是天然存在于體內(nèi)的21-22nt的非編碼RNA分子，是一類通過轉(zhuǎn)錄后基因 沉默對靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的RNA。據(jù)估計，生物體內(nèi)約有1/3的基因受miRNA的調(diào)控。 miRNA與RISC的復(fù)合體通過堿基配對可與靶基因mRNA5' -UTR或者3' -UTR中的互補序列 相結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯，或是引發(fā)mRNA降解，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。
[0004] 檢測miRNA的表達(dá)水平可以為癌癥的臨床診斷提供參考。而miRNA的異常表達(dá)直 接導(dǎo)致一些與疾病發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)異常，誘發(fā)癌癥的發(fā)生。已有報道證明miRNA可以 通過調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá)，在肝硬化中起重要作用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)miRNA-924的在肝 硬化患者中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照正常組，miRNA-924的表達(dá)異常和肝硬化的發(fā)生發(fā)展相 關(guān)，這為肝硬化的miRNA的臨床治療提供了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供miRNA-924在肝硬化診斷和治 療中的應(yīng)用。相比傳統(tǒng)的肝硬化的診斷方法，使用miRNA來診斷肝硬化具有及時性、靈敏 性、特異性、，從而使患者了解病情，進(jìn)而采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了miRNA-924在制備診斷肝硬化的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述miRNA-924選 自以下組中的至少一種：miRNA-924初始miRNA、miRNA-924前體miRNA、成熟miRNA-924 ;所 述miRNA-924初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA-924 ;所述miRNA-924前 體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA-924。
[0008] 進(jìn)一步，所述miRNA-924是成熟miRNA-924,核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的miRNA-924包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其顯 示完整miRNA-924核酸分子相同的功能，它們可能通過核苷酸殘基的缺失、置換或者插入 而突變。
[0010] 本領(lǐng)域人員熟知，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可以在miRNA的一端或者兩端增加保 護(hù)性堿基，如TT，也可對miRNA堿基進(jìn)行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知，在不影響miRNA-924功能的條件下，對miRNA-924進(jìn)行堿基修飾或者在兩端增加 堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] 雖然在某些【具體實施方式】中所使用的是成熟miRNA-924,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以預(yù)期，初始miRNA(pri-miRNA-924)、前體miRNA(pre-miRNA-924)將可以獲得與成熟 miRNA-924同樣的技術(shù)效果，因為細(xì)胞有能力進(jìn)一步將初始miRNA(pri-miRNA-924)、前體 miRNA(pre-miRNA-924)加工為成熟miRNA-924。
[0012] 本發(fā)明的miRNA-924核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的miRNA-924 主要呈單鏈形式，而miRNA-924前體是部分自互補的，以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的核酸分子 可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0013] 本發(fā)明提供了miRNA-924在高通量測序平臺中的應(yīng)用。通過高通量測序能獲知待 檢測樣本中miRNA-924的表達(dá)水平，將待測樣本的結(jié)果同健康人的樣本相比，容易判斷待 測樣本是否患有肝硬化。因此，通過高通量測序獲知miRNA-924表達(dá)水平與肝硬化的發(fā)生 發(fā)展相關(guān)的應(yīng)用同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0014] 本發(fā)明提供了一種診斷肝硬化的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測miRNA-924的表達(dá) 水平來診斷肝硬化。
[0015] 進(jìn)一步，上面所述的產(chǎn)品包括芯片或試劑盒；其中，所述芯片包括固相載體；以及 固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于上面所述 的miRNA-924的部分或全部序列。所述試劑盒包括用于檢測上面所述的miRNA-924的表達(dá) 水平的試劑，所述檢測miRNA-924表達(dá)水平的試劑包括針對miRNA-924的引物和/或探針。
[0016] 進(jìn)一步，上面所述的寡核苷酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的可用于診 斷肝硬化的miRNA的寡核苷酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同一芯片上通過檢測 多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷肝硬化的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上面所述試劑還 包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的診斷肝硬化miRNA的引物和/或探針。將多種miRNA的檢 測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷肝硬化的情況也 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017] 進(jìn)一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料， 例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(tuán)（如醛基、氨基等）修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑 料片等。
[0018] 所述的miRNA芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法，例如， 如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡 核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預(yù)定的序 列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨 基修飾，則其制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》； J.L.erisi,V.R.Iyer,P. 0.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolof geneexpressiononagenomicscale.Science，1997 ;278:680和馬立人，蔣中華主編?生 物芯片.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000,1-130。
[0019] 本發(fā)明提供了上面所述的miRNA-924在制備治療肝硬化藥物中的應(yīng)用。
[0020] 進(jìn)一步，所述藥物包含促進(jìn)所述miRNA-924表達(dá)或增強miRNA-924功能的試劑。 所述促進(jìn)miRNA-924表達(dá)或增強miRNA-924功能的試劑的靶標(biāo)不限于miRNA-924本身，還 包括miRNA-924的上下游，例如：編碼miRNA-924的基因組序列，miRNA-924靶基因、調(diào)控 miRNA-924的蛋白或者基因。
[0021] 進(jìn)一步，促進(jìn)miRNA-924表達(dá)或增強miRNA-924功能的試劑包括蛋白、寡核苷酸、 小分子化合物。
[0022] 優(yōu)選地，所述的試劑是miRNA-924的模擬物、miRNA-924的激動劑、前體 miRNA-924、攜帶miRNA-924 的載體。
[0023] 根據(jù)miRNA-924序列設(shè)計出它的模擬物或激動劑，miRNA-924的模擬物是化學(xué)合 成的小RNA，miRNA-924的激動劑是經(jīng)過特殊標(biāo)記和化學(xué)修飾的雙鏈小RNA，將miRNA-924模 擬物或者激動劑轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)后，它們能夠明顯上調(diào)miRNA-924的表達(dá)。
[0024] 本發(fā)明提供了一種治療肝硬化的藥物，所述藥物包括上面所述的促進(jìn)miRNA-924 表達(dá)或增強miRNA-924功能的試劑。
[0025] 本發(fā)明還提供了上面所述的促進(jìn)miRNA-924表達(dá)或增強miRNA-924功能的試劑在 制備治療肝硬化藥物中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明的miRNA-924可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達(dá) miRNA-924的DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核表達(dá)載體。
[0027] 病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒（例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）載體、甲病毒載 體。
[0028] 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 pcDNA3. 0表達(dá)載體、pcDNA3. 1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEFBos表達(dá)載體、pTet表 達(dá)載體、PTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0029] 可以表達(dá)miRNA-924的DNA片段可以通過如下方式獲?。簭膍iRNA數(shù)據(jù)庫中 (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)尋找miRNA-924 在基因組上的位置及具體 序列信息，根據(jù)基因組序列確定miRNA-924初始miRNA的位置，在miRNA-924初始miRNA 位置的上下游500-800bp區(qū)間內(nèi)設(shè)計特異性引物，擴增引物中間的序列即可獲得表達(dá) miRNA-924 的DNA片段。
[0030] 本發(fā)明的治療肝硬化的藥物還包含藥物學(xué)上可以接受的載體，所述載體包括但不 限于：稀釋劑、緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧劑、透皮 吸收劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。
[0031] 所述藥物可以制成包括但不限于顯微注射劑、適于轉(zhuǎn)染的劑型、注射液、片劑、粉 劑、粒劑、膠囊劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
[0032] 所述藥物可以單獨施用或者與其他能夠抑制肝硬化的藥物進(jìn)行組合施用。
[0033] 所述藥物可以離體施用：將miRNA-924模擬物、miRNA-924的激動劑、前體 miRNA-924或者miRNA-924的表達(dá)載體在體外導(dǎo)入或轉(zhuǎn)染人體自身或異體細(xì)胞（或異種細(xì) 胞），經(jīng)體外細(xì)胞擴增后，輸回人體。
[0034] 所述藥物可以體內(nèi)施用：將miRNA-924模擬物、miRNA-924的激動劑、前體 miRNA-924或者miRNA-924的表達(dá)載體直接導(dǎo)入體內(nèi)。這種載體可以是病毒型或非病毒性， 甚至是裸DNA或RNA。
[0035] 所述的受試者可以是人類或者其他哺乳動物。更具體地，受試者是器官、組織、細(xì) 胞。
[0036] 本發(fā)明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0037] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0038] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了miRNA-924表達(dá)水平與肝硬化的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過檢測受試 者miRNA-924的表達(dá)水平，可以判斷受試者是否患有肝硬化，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者 提供預(yù)防方案或者治療方案。
【附圖說明】
[0039] 圖1顯示利用QPCR檢測miRNA-924在肝硬化患者活檢組織中的表達(dá)情況；
[0040] 圖2顯示miRNA-924模擬物對miRNA-924表達(dá)的促進(jìn)作用。
【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 實施例1與肝硬化相關(guān)的miRNA的篩選
[0045] 1、樣本獲?。焊魇占?0例健康人的活檢組織和肝硬化患者的活檢組織樣本。上述 所有樣本的取得均通過組織倫理委員會的同意。
[0046] 2、樣本總RNA的提取
[0047] 使用QIAGEN公司的組織