加入至Col2-ll。然后，將IOOyL從Coll轉(zhuǎn)移至Col2,小心地慢慢混合（不起氣 泡）8-10次，然后繼續(xù)將100 1^從(：〇12轉(zhuǎn)移至(：〇13，并重復(fù)直至到達(dá)(：〇111。留下(：〇112 為未刺激的對照孔。然后，用連續(xù)稀釋的野生型（WT)犬瘦素和實(shí)施例1的PEG化多肽刺激 細(xì)胞。將細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，并且小心地從各個(gè)孔吸出培養(yǎng)基。然后，將l〇〇yL/孔的連續(xù) 稀釋的WT和PEG化多肽從深孔稀釋塊轉(zhuǎn)移至96孔測定板中的細(xì)胞。然后，水平越過下一 可用行建立所測試的WT和PEG化多肽的一式兩份樣品。將板在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵 育16-18小時(shí)。以下顯示了具有以ng/mL計(jì)的最終濃度的板格式。
[0035]
[0036] 第三天
[0037] 在第三天，準(zhǔn)備底物，并添加至細(xì)胞，然后由光度計(jì)測量它們。在讀取板之前大 約1-2小時(shí)，在室溫下解凍一組Steady-Glo(Promega)試劑，其包括：每測定板一小瓶 的Steady-Glo凍干的螢光素酶測定底物和一小瓶的Steady-Glo螢光素酶測定緩沖液。 將螢光素酶測定緩沖液（~10. 5mL)的全部內(nèi)容物移液到凍干的螢光素酶底物中。將 100yL/孔的重構(gòu)的螢光素酶底物添加至測定板的每個(gè)孔，并且用鋁箱覆蓋測定板，并在室 溫下在設(shè)置為450至600rpm的板搖動器上孵育45-60分鐘。然后，在TecanGENiosPRO 板讀取器上用設(shè)置為250毫秒的積分時(shí)間來讀取板。然后，將數(shù)據(jù)輸入到Excel中，在 SigmaPlotApplication上進(jìn)行EC50測定，并且也進(jìn)行了相對于WT瘦素的倍數(shù)損失活性 (foldlossactivity)和百分比相對效力測定。將相對于野生型犬瘦素的倍數(shù)損失活性測 定為[樣品的EC50]除以[野生型瘦素的EC50];瘦素蛋白與參考標(biāo)準(zhǔn)品的％相對效力通過 用參考標(biāo)準(zhǔn)品的EC50除以瘦素蛋白的EC50值并乘以100來計(jì)算。例如，％相對效力計(jì)算 為[參考標(biāo)準(zhǔn)品的EC50]除以[樣品的EC50]X100。下表顯示了使用這些方法分析的WT 和實(shí)施例1的PEG化多肽。
[0038] 表 1
[0039]
[0040] 結(jié)果表明實(shí)施例1的PEG化多肽在體外是有活性的。
[0041 ] 體內(nèi)牛物數(shù)據(jù)
[0042] 這個(gè)研究的目的是評價(jià)實(shí)施例1的PEG化多肽對肥胖的雄性和雌性犬中體重、身 體組成和喂養(yǎng)行為的影響。將實(shí)施例1的PEG化多肽在有7. 4的pH和4% (w/v)海藻糖的 磷酸鹽緩沖鹽水中配制成5.lmg/ml。
[0043] 使用十八（18)只全部超過一（1)歲齡的犬：九（9)只未閹割的雄性和九（9)只未 閹割的雌性小獵犬。犬是肥胖的，重約12至18kg(26. 4至39. 61bs)。在第一個(gè)四周的適應(yīng) 期期間，（或者直至達(dá)到所需的起始重量），犬飼喂實(shí)驗(yàn)室高脂肪（約45%)的干燥食物， 其滿足或超過維持和健康的營養(yǎng)需求。在適應(yīng)期的這個(gè)部分所有的犬都自由飼喂以促進(jìn)重 量增加。在適應(yīng)期的最后兩周期間和該研究的剩余時(shí)間，所有的犬均飼喂商品化的正常脂 肪（大約12% )的干燥犬糧，以便減少內(nèi)源性瘦素水平，并恢復(fù)瘦素敏感性。治療組1和2 中的犬在該研究的整個(gè)剩余時(shí)間期間繼續(xù)自由地提供食物。治療組3中的動物按照飲食的 標(biāo)簽說明每天飼喂兩次。通過碗或在各個(gè)籠中含有的自動給水系統(tǒng)，允許動物自由地獲取 水。在研究過程期間，不施用任何其它伴隨藥物。
[0044] 這個(gè)研究是在每一性別中作為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)來實(shí)施的。犬被隨機(jī)分配到圈。通過 在每一性別中基線（第-14天（Day-14))體重將動物劃分區(qū)組（blocked)。存在有三只雄 性的三個(gè)區(qū)組和有三只雌性的三個(gè)區(qū)組。雄性區(qū)組一由三只具有最低體重的雄性組成，且 雌性區(qū)組一將由三只具有最低體重的雌性組成。在每一性別中的第二區(qū)組由具有其次最低 體重的三只雄性和三只雌性組成。在每一性別中最后一個(gè)的區(qū)組包含具有最高體重的三只 雄性和三只雌性。
[0045] 下表顯示了使用的治療、劑量方案和動物數(shù)量。
[0046]表2
[0047]
[0048] 將動物分入九只動物的兩個(gè)性別組中。在每一性別組內(nèi)，基于第-14天的體重，將 動物從最低到最高排名?；跐u增的基線體重，將每一性別組中的動物分入三只動物的區(qū) 組中。使用由贊助商提供的隨機(jī)化表格，將動物隨機(jī)分配至圈位置。
[0049] 通過皮下注射在第0、7、14、21、28天向?qū)φ蘸椭委熃M施用。在將動物轉(zhuǎn)換至低脂 肪配給之前，在第-14天研究中登記之前，獲得血清樣品（大約2_3ml)，以便使犬適應(yīng)放血 操作，并建立基線內(nèi)源性瘦素水平。下表提供了在第-14天和第-1天的循環(huán)瘦素水平。
[0050]表 3
[0051]
[0052] 在第-1天、第21天和第42天（研究的最后一天），將所有三個(gè)治療組中的動物都 進(jìn)行DEXA(雙能X射線吸收法）掃描，以確定瘦肉相比于脂肪組織的百分比。
[0053] 對于登記在治療組1和2中的動物，在第-7天至第42天在大約各自相同的時(shí)間， 記錄每天的飼料消耗。
[0054] 在所有治療組中的動物在第-7天開始每天24小時(shí)錄像記錄，并持續(xù)至研究結(jié)束， 來觀察包括每天進(jìn)餐次數(shù)和每餐飼喂的平均持續(xù)時(shí)間在內(nèi)的飼喂行為。
[0055] 在研究過程中每周各個(gè)動物體重中的初級終點(diǎn)（primaryendpoint)將改變，并且 這些將被概述并與治療組比較。次級終點(diǎn)將是：
[0056] 1)身體組成：在研究過程中將概述各個(gè)動物的DEXA掃描結(jié)果（包括瘦肉和脂肪 組織的百分比）；和
[0057] 2)飼料消耗/飼喂行為：對于每一動物，將概述在治療1和2中各個(gè)動物的平均 每天飼料消耗。
[0058] 將觀察記錄各個(gè)動物飼喂行為的錄像來確定在開始治療之前和在開始治療之后 每一動物消耗的進(jìn)餐次數(shù)和進(jìn)餐持續(xù)時(shí)間。
[0059] 對體重影響的結(jié)果提供在下表中。
[0060] 表 4
[0061]
[0062] Ap= 0. 001；Bp= 0. 002〇
[0063] 這些結(jié)果表明：與對照組相比，用實(shí)施例1的化合物治療的組減輕了更多的重量。
[0064] 對身體組成的影響提供在下表中。
[0065]表 5
[0066]
[0067] Ap= 0. 006；Bp= 0. 049；cp= 0. 022；Dp= 0. 038〇
[0068] 這些結(jié)果表明：與對照組相比，用實(shí)施例1的化合物治療的組具有與脂肪組織百 分比優(yōu)先降低相關(guān)的身體狀況評分（bodyconditionscores)中的減少并且對組織的百分 比沒有顯著影響。
[0069] 對飼料消耗和行為的影響提供在下表中。
[0070] 表 6
[0071]
[0072] 這些結(jié)果表明：與對照組相比，用實(shí)施例的化合物治療的組消耗更少的食物，并且 與每天消耗的進(jìn)餐次數(shù)相反，食物攝入的減少與進(jìn)食花費(fèi)的時(shí)間減少相關(guān)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種包含SEQ ID NO :1的多肽和聚乙二醇（PEG)部分的化合物，其中所述PEG部分 共價(jià)連接至所述SEQ ID NO :1的多肽的對-乙酰-苯丙氨酸（pAF)殘基。2. 權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述PEG部分具有約30k Da的分子量。3. 權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述PEG部分是a -甲基-co -氨基乙氧基氨基甲酰 基、或聚氧乙烯。4. 一種治療陪伴動物中肥胖的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化 合物施用至有需要的動物。5. -種預(yù)防陪伴動物中肥胖的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化 合物施用至有需要的動物。6. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化合物，其用于治療。7. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化合物，其用于治療動物中的肥胖。8. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化合物，其用于預(yù)防動物中的肥胖。9. 一種組合物，其包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化合物和一種或多種載體、稀釋劑 或賦形劑。
【專利摘要】提供修飾的犬瘦素多肽及其制劑和用途，包括聚乙二醇(PEG)修飾的犬瘦素多肽，其中所述PEG部分共價(jià)連接至所述多肽的對-乙酰-苯丙氨酸(pAF)殘基，以及可用于治療陪伴動物肥胖和其它瘦素相關(guān)病癥的相關(guān)組合物和方法。
【IPC分類】C07K14/575
【公開號】CN105121461
【申請?zhí)枴緾N201480014677
【發(fā)明人】M·布勒瑟, P·C·肯寧, M·德古斯曼, N·克努森, I·瓦倫塔
【申請人】伊萊利利公司, Ambrx公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2014年3月12日
【公告號】CA2901928A1, WO2014165189A2, WO2014165189A3