用于細(xì)胞動(dòng)靜態(tài)交替培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)及其方法
【專利說明】用于細(xì)胞動(dòng)靜態(tài)交替培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)及其方法
[0001]發(fā)明人:張永新
[0002]這個(gè)專利的優(yōu)先權(quán)要求基于于2012年10月18日在美國提出的申請(qǐng)?zhí)枮?1/715555的臨時(shí)申請(qǐng)，部分優(yōu)先權(quán)基于2012年3月29日提出的申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2012/000182的PCT申請(qǐng)，該P(yáng)CT申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基于2011年3月29日提交的美國專利N0.PCT/US2012/000182的專利臨時(shí)申請(qǐng)。
[0003]相關(guān)專利
[0004]這個(gè)專利是2012年3月29日的PCT/US2012/000182的部分?jǐn)U展，優(yōu)先權(quán)日為申請(qǐng)臨時(shí)專利61/468573的2011年3月29日，也是2012年3月30日申請(qǐng)的專利13435250的部分，這個(gè)專利也是2012年10月18日美國臨時(shí)申請(qǐng)61/715555的擴(kuò)展。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]細(xì)胞培養(yǎng)可能在三種狀態(tài)下進(jìn)行，即靜態(tài)、動(dòng)態(tài)和動(dòng)靜交替，本發(fā)明涉及一種可以在同一細(xì)胞培養(yǎng)容器中進(jìn)行這三種狀態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器。
[0006]發(fā)明背景
[0007]大體來說，本申請(qǐng)生物反應(yīng)器有關(guān)，具體地說是可以在同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器中使細(xì)胞在靜態(tài)、動(dòng)態(tài)和動(dòng)靜態(tài)交替三種狀態(tài)中生長的生物反應(yīng)器。
[0008]許多種類的細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞和免疫細(xì)胞，在培養(yǎng)時(shí)對(duì)剪切力十分敏感。比如，剪切力可以在干細(xì)胞培養(yǎng)中導(dǎo)致非特異性分化，增加細(xì)胞凋亡，從而極大地降低干細(xì)胞擴(kuò)增和定向分化的效率。較高的剪切力還可能在蛋白表達(dá)中釋放出更多的非特異性蛋白，需要的特異性蛋白在培養(yǎng)中比例減小，蛋白純化難度大大增加。靜置培養(yǎng)的剪切力雖然最小，但靜置培養(yǎng)的細(xì)胞通常在培養(yǎng)容器的底部，那么如果細(xì)胞密度較大，一些細(xì)胞無法獲得足夠的營養(yǎng)，因此不適合用于大規(guī)模的細(xì)胞擴(kuò)增。一些生物反應(yīng)器，比如NASA的室壁旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(RWV)，就是為降低剪切力而設(shè)計(jì)的。但是，這些生物反應(yīng)器，必須通過不斷地運(yùn)動(dòng)、攪拌和/或攪動(dòng)細(xì)胞使細(xì)胞保持懸浮。一旦生物反應(yīng)器停止運(yùn)轉(zhuǎn)，細(xì)胞將累積在底部某個(gè)位置或者培養(yǎng)容器的某個(gè)部位，而且是不均勻地分布，這對(duì)于絕大多數(shù)細(xì)胞生長是有害的，至少不利于細(xì)胞有效增長。因此，雖然這樣的生物反應(yīng)器的剪切力有所減少，但是當(dāng)生物反應(yīng)器運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，仍有剪切力持續(xù)作用于培養(yǎng)的細(xì)胞上。毫無疑問，一個(gè)間歇性的攪拌，或者適當(dāng)?shù)膭?dòng)靜態(tài)交替培養(yǎng)，不僅會(huì)使剪切力最小化，而且能為細(xì)胞提供一個(gè)理想的代謝環(huán)境。然而，因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)的細(xì)胞的慣性作用，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)通常很難使細(xì)胞均勻分布。當(dāng)細(xì)胞分布不均勻時(shí)(例如細(xì)胞局部堆積或者聚集)將對(duì)細(xì)胞生長很有害。我們現(xiàn)在發(fā)明提供了能使細(xì)胞在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞后仍能均勻分布的方法，以致所有的三種細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)都可以在目前公開的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中應(yīng)用。
[0009]一些其他生物反應(yīng)器，比如由Felder及其同事發(fā)明的，其中動(dòng)態(tài)和靜態(tài)培養(yǎng)是在不同的兩個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器中進(jìn)行的，由傳遞細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)狀態(tài)傳遞到另一個(gè)培養(yǎng)容器的另一種狀態(tài)，在培養(yǎng)容器的傳遞過程中，不可避免造成細(xì)胞損失和損傷。在我們現(xiàn)在的發(fā)明中，動(dòng)靜兩態(tài)都在同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器中進(jìn)行，在狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中不需要轉(zhuǎn)換培養(yǎng)容器，當(dāng)細(xì)胞從動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換成靜態(tài)時(shí)，細(xì)胞可以均勻分布在細(xì)胞腔的底部或者吸附在攪拌材料的表面。因此，我們的發(fā)明為細(xì)胞在懸浮狀態(tài)和靜置狀態(tài)生長都提供了最佳的條件，并且兩種狀態(tài)可以反復(fù)轉(zhuǎn)換。
[0010]一些生物反應(yīng)器使用由磁性葉輪控制的磁性元件(尤其葉片或翼片)，用于攪拌培養(yǎng)基，保持細(xì)胞在懸浮狀態(tài)。這種生物反應(yīng)器專門增加剪切力，用于滿足某些細(xì)胞的培養(yǎng)要求，細(xì)胞的分布隨著培養(yǎng)基攪拌停止時(shí)葉輪的方向而定。較大的剪切力和靜態(tài)時(shí)不均勻的分布與我們發(fā)明的生物反應(yīng)器有明顯的不同。除了應(yīng)用差別以外，我們發(fā)明的生物反應(yīng)器，不使用葉片或翼片作為磁性元件，我們發(fā)明中的磁珠如果不在磁場中實(shí)際上沒有磁性，只有將它們放入磁場，它們才有磁性。我們發(fā)明中的磁珠不由葉輪控制，而是由磁場強(qiáng)度變化控制磁珠運(yùn)動(dòng)。
[0011]在我們的生物反應(yīng)器的一個(gè)實(shí)例中，為了在攪拌時(shí)減小剪切力，以及在使細(xì)胞均勻分布，我們的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的攪拌器在細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)部兩端的運(yùn)動(dòng)是與反應(yīng)容器與之協(xié)調(diào)的的倒轉(zhuǎn)結(jié)合形成的。相比而言，其他生物反應(yīng)器通過攪拌或者培養(yǎng)容器運(yùn)動(dòng)使細(xì)胞懸浮，這兩者都不能使細(xì)胞在攪拌過程中均勻分布，這都會(huì)在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生較大的剪切力。這兒需要強(qiáng)調(diào)的是我們的系統(tǒng)中，培養(yǎng)容器的翻轉(zhuǎn)不是為了細(xì)胞懸浮，相反，在我們的設(shè)計(jì)中希望最小化細(xì)胞培養(yǎng)容器翻轉(zhuǎn)對(duì)細(xì)胞分散的影響，因?yàn)槿萜鞯倪\(yùn)動(dòng)會(huì)引起細(xì)胞在靜止?fàn)顟B(tài)的分布不均勻。細(xì)胞培養(yǎng)容器的翻轉(zhuǎn)主要是為攪拌器從容器的一端運(yùn)動(dòng)到另一端提供一個(gè)適宜的條件。
[0012]在另一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞的靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變是在垂直培養(yǎng)以及水平培養(yǎng)之間轉(zhuǎn)變，細(xì)胞培養(yǎng)容器的旋轉(zhuǎn)速度以及從旋轉(zhuǎn)到靜止的減速是影響細(xì)胞在靜態(tài)時(shí)分布的兩個(gè)主要因素。更高或者更低的轉(zhuǎn)速以及減速速率將引起細(xì)胞接下來轉(zhuǎn)動(dòng)過程中不均勻分布。我們已經(jīng)研究出合適的轉(zhuǎn)動(dòng)以及減速速率。
[0013]在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)靜態(tài)及動(dòng)態(tài)的時(shí)長和動(dòng)靜態(tài)轉(zhuǎn)換的頻率顯著影響細(xì)胞生長，并且不同細(xì)胞都不一樣，由細(xì)胞種類、培養(yǎng)基、細(xì)胞密度(細(xì)胞濃度)、和細(xì)胞倍增速率(細(xì)胞增長速率)決定。
[0014]在我們以前的專利中，有些內(nèi)容已被提及但沒有在權(quán)力要求中清楚列出。在本專利中，這些都在權(quán)利要求中清楚的列出了。
[0015]摘要
[0016]本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征是所有三種狀態(tài)的培養(yǎng)，即靜態(tài)、動(dòng)態(tài)、和動(dòng)靜態(tài)交替培養(yǎng)可以在同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器中進(jìn)行，而且強(qiáng)調(diào)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)之后的靜態(tài)培養(yǎng)中的細(xì)胞的均勻分布。本發(fā)明中的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，聯(lián)合應(yīng)用磁控?cái)嚢韬团囵B(yǎng)容器翻轉(zhuǎn)以及聯(lián)合應(yīng)用垂直旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)和水平靜止培養(yǎng)為兩個(gè)建造理想生物反應(yīng)器的策略，它們使動(dòng)靜態(tài)交替培養(yǎng)在同一細(xì)胞培養(yǎng)容器的反應(yīng)器中進(jìn)行，并可以盡可能減小剪切力以及為細(xì)胞培養(yǎng)提供一個(gè)理想的代謝環(huán)境。
[0017]現(xiàn)在發(fā)明的生物反應(yīng)系統(tǒng)可以是細(xì)胞在三種狀態(tài)生長，特別是動(dòng)靜交替的狀態(tài)，但是這個(gè)系統(tǒng)也可以單獨(dú)用于動(dòng)態(tài)或者靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)。在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可以用任意方式再懸浮，包括但不限于磁力攪拌和培養(yǎng)容器翻轉(zhuǎn)。
[0018]權(quán)利要求2中所說的細(xì)胞在靜態(tài)時(shí)均勻分布可以在細(xì)胞培養(yǎng)容器的底部或者在任何材料上分布在培養(yǎng)容器的底部，或者培養(yǎng)容器內(nèi)部的任意部位。
[0019]我們發(fā)明的生物反應(yīng)器可以培養(yǎng)所有種類的細(xì)胞，包括懸浮細(xì)胞、粘附細(xì)胞和部分粘附細(xì)胞。培養(yǎng)粘附細(xì)胞時(shí)，可以在吸附在載體上生長。
[0020]根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)包括細(xì)胞在載體上運(yùn)動(dòng)，載體圍繞細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、培養(yǎng)容器運(yùn)動(dòng)或者以上的任意組合。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)基中運(yùn)動(dòng)，粘附細(xì)胞吸附在攪拌器或者載體上運(yùn)動(dòng)。為了使在細(xì)胞再懸浮或者攪拌產(chǎn)生更小的剪切力，應(yīng)用程序有攪拌器垂直運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞培養(yǎng)容器垂直旋轉(zhuǎn)兩個(gè)選項(xiàng)，其他方法也可以用于這個(gè)生物反應(yīng)器的間歇性懸浮培養(yǎng)。
[0021]生物反應(yīng)器的靜止?fàn)顟B(tài)包括細(xì)胞相對(duì)于培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器或者細(xì)胞生長的環(huán)境都相對(duì)靜止。在有些案例中，細(xì)胞吸附在載體上，載體有可能在培養(yǎng)容器壁上，相對(duì)于培養(yǎng)容器不運(yùn)動(dòng)，雖然不是通常所說的在容器底部的靜止?fàn)顟B(tài)但也可以認(rèn)為是靜止培養(yǎng)。
[0022]細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的各種細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)可以在權(quán)利要求4所述的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和權(quán)利要求5所述的靜止?fàn)顟B(tài)間通過程序調(diào)控自由的任意轉(zhuǎn)換，這種轉(zhuǎn)換包括了在時(shí)間、速度以及頻率方面的轉(zhuǎn)換。我們發(fā)現(xiàn)了下述因素之間的相互關(guān)系:動(dòng)態(tài)或靜態(tài)的時(shí)期，動(dòng)靜態(tài)交替的頻率，細(xì)胞密度，細(xì)胞生長速率(細(xì)胞倍增速率)，細(xì)胞產(chǎn)量和由細(xì)胞死亡和凋亡率，細(xì)胞非特異性分化，干細(xì)胞移植潛能來評(píng)價(jià)的細(xì)胞質(zhì)量。
[0023]現(xiàn)在發(fā)明的生物反應(yīng)器系統(tǒng)包含細(xì)胞培養(yǎng)容器翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)和磁性攪拌系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞通過由電磁鐵控制的攪拌器達(dá)到懸浮狀態(tài)。當(dāng)攪拌器上浮，細(xì)胞跟著攪拌器上浮。當(dāng)攪拌器到達(dá)培養(yǎng)容器頂部時(shí)，他們被電磁鐵吸附在頂端，隨后培養(yǎng)容器翻轉(zhuǎn)180°，使攪拌器隨著培養(yǎng)容器變位于培養(yǎng)容器的最低處(底部)。