新型連接酶活性的制作方法
【專利說明】新型連接酶活性
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 通過互補RNA夾持的單鏈（ss)DNA寡核苷酸的連接是技術如RNA介導的退火、選擇 和連接（RASL)中的關鍵步驟。T4DNA連接酶已經(jīng)用于RASL以及其它RNA分析和檢測技術如 分子倒置探針、改良的連接酶鏈反應和連接酶檢測反應（例如，Yeakley, et al.，Nat Biot echnol. , 20(4):353-8(2002), Bullard and Bowater, Biochem. J. , 398 (I):135-44 (2006)； Li, et al.，Curr Protoc Mol Biol. Apr !Chapter 4:Unit 4.13.1-9(2012);美 國公開申請?zhí)?2011/0092375、美國專利號 7,361，488 ;Nilsson，et al.，Nature Biotechnology, 18:71 (2000) ；Nilsson,et al. , Science, 265, 2085-2088 (1994)； Barany1PCR Methods Appl. , 1:5-16(1991) ；Landegren, Bioessays, 15:761-765(1993)； ffiedmann, et al. ,PCR Methods Appl. ,3 : S51-64(1994) ；Nilsson,et al. , Nat Genet. , 16:252-255 (1997) ；Baner,et al. ,Nucleic Acids Res. , 26:5073-5078 (1993)； Hardenbol,et al., Nature Biotechnol.,21:673-678 (2003);以及 Landegren, Methods Cell Biol. , 75:787-797(2004))) 〇
[0003] T4DNA連接酶不佳地需要例如長溫育時間、高濃度的連接酶和低ATP濃度來發(fā)揮 作用，以克服腺苷酸化DNA副產(chǎn)物的優(yōu)先形成從而完成連接。
[0004] T4RNA連接酶作為連接與RNA模板或夾板（splint)雜交的DNA鏈的替代選擇被測 試（美國專利號6, 368, 801)。據(jù)報道，來自迀徙蚱M (Melanoplus sanguinipes)昆蟲痘病 毒的NAD+依賴性連接酶對與RNA雜交的DNA具有類似于T4DNA連接酶的連接活性，但僅在 Mn 2+存在的情況下具有（Lu, et al.，Biocimica et Biophysica Acta, 1701:37-48 (2004))。 Sriskanda, et al.，Nucleic Acid Research, 26 (15) :3536-3541 (1998)報道了來自綠草 履蟲（Paramecium bursaria)小球藻病毒的PBCV-1DNA連接酶，其中實驗數(shù)據(jù)顯示該連接 酶可在DNA模板或DNA夾板上連接寡核苷酸，但不能在RNA模板或RNA夾板上連接寡核苷 酸。這些結果通過晶體結構研究進行解釋，其中作者顯示PBCV-I連接酶迫使底物進入帶切 口的底物一側上的RNA類A型螺旋，但需要在切口的一側上的DNA類B型螺旋提供5'磷酸 (Ho, et al. , J. Virol. , 71 (3) : 1931 (1997) ；Sriskanda, et al. , (1998) ；Nair, et al. , Nat. Struct. Mol. Biol. , 14:770-778 (2007))。相似的結果報道于 NAD 依賴性大腸桿菌（E. coli) DNA 連接酶（Nandakumar, Mol. Cell, 26:257-271 (2007))和人 DNA 連接酶 I (Pascal, et al.，Nature, 432:473-478 (2004))的晶體結構中，導致得出這些連接酶不能接受RNA夾持 的DNA作為連接底物的結論。
[0005] 發(fā)明概沐
[0006] 總體上，在一方面，提供組合物，其包含在緩沖液中的RNA夾板（splint)連接酶和 至少一種具有至少8個核苷酸長度的多核苷酸。一方面，RNA夾板連接酶是熱穩(wěn)定的。另 一方面，RNA夾板連接酶被固定在珠上。另一方面，夾板連接酶為PBCV-I連接酶。
[0007] 組合物的實施方式可包括下列特征的一個或多個：RNA夾板連接酶和至少一種多 核苷酸具有連接酶比多核苷酸為大于100:1或小于100:1、10:1或1:1的摩爾比；緩沖液包 含 I yM-1. 5mM 的 ATP。
[0008]總體上，在一方面，提供連接兩種多核苷酸片段的方法，多核苷酸片段為單鏈或具 有單鏈區(qū)域或者為雙鏈但適于變性，該方法包括：將至少兩種多核苷酸片段如具有與RNA 夾板互補的區(qū)域的DNA多核苷酸片段與RNA夾板連接酶組合；和允許這兩種多核苷酸連接 以形成單一多核苷酸。另一方面，多核苷酸片段是DNA片段，該DNA片段是復雜混合物的一 部分，而RNA夾板具有預定的序列?？蛇x地，DNA片段具有確定的序列，而RNA夾板是RNAs 復雜混合物的一部分。
[0009] 方法的實施方式可包括以下特征中的一個或多個：在含有至少I yM-1. 5mM ATP 緩沖液中進行連接反應；利用具有大于8個核苷酸長度的RNA夾板和各自具有大于8個核 苷酸長度的多個多核苷酸，溫育反應少于6個小時，以實現(xiàn)至少70% -90 %的多核苷酸連 接；溫育反應少于1個小時，以實現(xiàn)至少70% -90%的多核苷酸連接；和/或以大于100:1 或小于100:1、10:1或1:1的酶：底物摩爾比進行連接反應。在某些實施方式中，在相似條 件下，RNA夾板連接酶的連接可比使用T4DNA連接酶的連接更迅速地發(fā)生；單鏈多核苷酸可 以是用于定量PCR的模板，以使得所連接的單鏈多核苷酸的擴增產(chǎn)生比當用T4DNA連接酶 替換RNA夾板連接酶時所觀察到的更少的非模板多核苷酸背景擴增，和/或夾板連接酶能 夠在相同的反應條件下和使用相同的多核苷酸以比T4DNA連接酶快至少5倍或10倍的速 率連接多核苷酸。
[0010] 總體上，另一方面，提供分析mRNA的剪接歷史的方法，包括：通過將ssDNA寡核苷 酸與mRNA和RNA夾板連接酶組合，確認剪接點、剪接變體或剪接點處的突變。
[0011] 總體上，另一方面，提供檢測RNA序列的方法，包括：使具有在連接點與夾板RNA互 補的區(qū)域的多核苷酸退火；使用RNA夾板連接酶連接多核苷酸、擴增連接產(chǎn)物；和檢測和任 選地定量擴增產(chǎn)物。
[0012] 方法的實施方式可包括以下特征的一個或多個：RNA序列是微小RNA;和/或RNA 夾板連接酶是PBCV-I連接酶。
【附圖說明】
[0013] 圖1概述了對由DNA或RNA模板夾持的DNA連接的測定。預退火的帶切口的底物 如20脫氧核苷酸受體DNA、30脫氧核苷酸、FAM標記的和5'磷酸化的供體DNA以及DNA或 RNA反向互補序列（夾板），與合適的連接酶溫育，然后用IOOmM EDTA淬滅并用甲酰胺變性。 可分離片段，并且通過毛細管電泳檢測FAM標記的ssDNA連接產(chǎn)物。
[0014] 圖2 (A)-2 (D)顯示由DNA或RNA夾持的兩種DNA寡核苷酸的連接（DNA-DNA連接）。 明顯的峰是通過與可靠的標準品共洗脫確認的未反應的PDNA(I)和連接產(chǎn)物（II)。IOOnM 的標準寡核苷酸與IOOnM PBCV-1DNA連接酶（2(B)和2(D))或IOOnM T4DNA連接酶（2(A) 和2(C))在20°C下反應30分鐘。
[0015] 組2(A)和2 (B):兩個DNA寡核苷酸與DNA2(A)和2 (B)雜交，在此峰對應于完全 連接。
[0016] 組2 (C)和2 (D):兩個DNA寡核苷酸與RNA反向互補序列雜交。只在使用PBCV-I 連接酶2 (D)的反應中觀察到對應于完全連接的峰，而使用T4DNA連接酶2 (C)沒有觀察到 連接。
[0017] 圖3 (A) -3 (B)顯示使用一系列濃度（lpM-10 yM)的T4DNA連接酶、T4RNA連接酶 1或PBCV連接酶，在20°C下在含有ImMATP的標準連接緩沖液中連接IOOnM預退火的、由 DNA夾持的標準寡核苷酸底物。
[0018] 3(A)DNA-DNA:由 DNA夾持的連接。
[0019] 3 (B)DNA-DNA :由RNA反向互補序列夾持的連接。
[0020] PBCV-1DNA連接酶和T4DNA連接酶均可以相似連接活性連接由DNA夾持的DNA寡 核苷酸，但只有PBCV-I連接酶可針對由RNA反向互補序列夾持的寡核苷酸底物形成可檢測 量的連接產(chǎn)物。T4RNA連接酶1對DNA夾持的連接具有輕微的活性，對RNA夾持的連接沒有 可檢測的活性。
[0021] 圖4 (A)-4 (B)顯示在20°C下在含有ImM ATP或IOy M ATP和IOOnM預退火的帶切 口的底物的標準連接緩沖液中，使用一系列濃度（lpM-10 y M)的T4DNA連接酶和PBCV-I連 接酶連接相同的由RNA反向互補序列夾持的寡核苷酸底物。
[0022] 4 (A):在ImM ATP存在的情況下由RNA反向互補序列夾持的DNA-DNA連接。
[0023] 4 (B):在10yMATP存在的情況下由RNA反向互補序列夾持的DNA-DNA連接。
[0024] 在含有ImMATP或10yMATP的緩沖液中，PBCV-I連接酶以相似的連接活性連接 由RNA夾持的DNA寡核苷酸。T4DNA連接酶僅在10yMATP下具有提高的活性，但在相同的 條件下，該活性比PBCV-I連接酶的活性至少小5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。PBCV-I 連接酶可在含有高ATP濃度的緩沖液中連接可檢測量的由RNA反向互補序列夾持的寡核苷 酸底物，而T4DNA連接酶不可以。
[0025] 圖5顯示在多種溫度下PBCV-I連接酶RNA夾持的DNA連接活性。在16°C、25°C和 37°C下進行由兩種不同RNA模板夾持的DNA-DNA連接。第一種DNA寡核苷酸及其反向互補 序列是圖9中所述的標準模板（正方形），還使用了具有Sriskanda, et al.，（1998)中所 述的序列（圓形）的第二種模板，其顯示序列對連接的作用很小或沒有作用。反應條件是 I yM PBCV-I連接酶、250nM RNA夾持的寡核苷酸底物在標準連接酶緩沖液中溫育30分鐘。
[0026] 圖6顯示使用RNA夾板連接酶的qPCR檢測的RASL測定設計。DNA探針被設計為 具有與RNA靶標互補的區(qū)域和