從杜仲葉中提取京尼平的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的提取方法，具體說是從杜仲葉中提取京尼平的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]杜仲(學(xué)名Eucommia ulmoides Oliver)，又名膠木，為杜仲科植物。杜仲游離氨基酸極少，含有的少量蛋白質(zhì)，是和絕大多數(shù)食品類似的完全蛋白，即能夠水解檢出對人體必需的8種氨基酸。測定了杜仲所含的15種礦物元素，其中有鋅、銅、鐵等微量元素，及鈣、磷、鉀、鎂等宏量元素。藥用杜仲，即為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，是中國名貴滋補藥材。其味甘，性溫。有補益肝腎、強筋壯骨、調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎的功效?？芍委熌I陽虛引起的腰腿痛或酸軟無力，肝氣虛引起的胞胎不固，陰囊濕癢等癥。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品?，F(xiàn)代研究杜仲具有清除體內(nèi)垃圾，加強人體細胞物質(zhì)代謝，防止肌肉骨骼老化，平衡人體血壓，分解體內(nèi)膽固醇，降低體內(nèi)脂肪，恢復(fù)血管彈性，利尿清熱，廣譜抗菌，興奮中樞神經(jīng)，提高白血球藥理作用。
[0003]京尼平(Genipin)由京尼平甙分解后分離提純而獲得，其主要用途有:京尼平可與氨基酸或者蛋白質(zhì)反應(yīng)，生成一種桅子藍色素，這種天然色素因其無毒性而被用于食品染料的制作；優(yōu)良的天然生物交聯(lián)劑:可以與蛋白質(zhì)、膠原、明膠和殼聚糖等交聯(lián)制作生物材料，如人造骨骼、傷口包扎材料等，其毒性遠低于戊二醛和其他常用化學(xué)交聯(lián)劑；可用于治療肝臟疾病、降壓、通便等。以色列一家醫(yī)療中心的研究結(jié)果表明，京尼平可以緩解II型糖尿病的癥狀；制備固定化酶的交聯(lián)劑；是迄今發(fā)現(xiàn)的環(huán)烯醚萜甙中抑制誘變劑誘變活性最強的物質(zhì)；也有文獻報道京尼平具有抗血栓抑制細胞凋亡的作用；總的來說，京尼平應(yīng)用廣泛，具有開發(fā)潛力，廣闊的市場前景和巨大的利用價值。
[0004]京尼平甙主要存在于桅子、杜仲等天然植物中，是提取京尼平甙的理想原料，國內(nèi)現(xiàn)有提取工藝方案中存在著提取率不高、產(chǎn)品純度低、能源消耗大、大量使用有機溶劑、廢水量大等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供從杜仲葉中提取京尼平的方法，具有工藝簡單，適合生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)，具體包括如下步驟:
[0007]I)預(yù)濕堆放:將杜仲葉在陰涼處建堆，噴水，待水從堆底部流出后，自然堆放；
[0008]2)原料處理:將步驟I)得到的杜仲葉粉碎或破碎，加入相當(dāng)于原料2-3倍重量的純凈水，加熱至50_60°C維持5-10分鐘，得到膏狀漿液；
[0009]3)第一次酶解:將步驟2)得到的膏狀漿液，調(diào)pH為4-5，加入膏狀漿液
0.05-0.1 %重量份的果膠-纖維素復(fù)合酶和0.001重量份的甘露醇進行酶解40-60分鐘，得到第一次酶解液；
[0010]4)去油:將步驟3)得到的第一次酶解液，加入2-3倍重量的純凈水，加熱至60-70°C浸提60-120分鐘，得上層浮油液與下層液、渣混合物，分離；
[0011]5)第二次酶解:將步驟4)得到的下層液、渣混合物，調(diào)pH為4.5，加入相當(dāng)于混合物0.1-0.2%重量份的纖維素酶進行酶解40-60分鐘，得到第二次酶解液，重復(fù)兩次；
[0012]6)柱層析:合并第二次酶解液，過濾，濃縮，通過柱層析，用大孔吸附樹脂進行吸附，用去離子水清洗樹脂至流出液體為無色，再用濃度為15-20%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；
[0013]7)第三次酶解:將步驟6)得到的洗脫液，調(diào)pH為4.5，加入β -葡萄糖苷酶進行酶解，酶的用量為洗脫液重量的5-10%，酶的濃度為lmg/ml，酶解溫度為50_60°C ；
[0014]8)柱層析:將步驟7)得到酶解液，通過柱層析，用大孔樹脂進行吸附，用去離子水清洗樹脂至流出液體為無色，再用濃度為10-20%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；
[0015]9)干燥:將步驟8)得到的洗脫液濃縮，再通過干燥得到粉末狀京尼平。
[0016]本發(fā)明步驟I)所述的預(yù)濕的堆放，優(yōu)選6-12小時。
[0017]步驟3)所述的果膠-纖維素復(fù)合酶，優(yōu)選活性是1-3萬活性單位/克(毫升)的固態(tài)或液態(tài)果膠-纖維復(fù)合酶。
[0018]步驟6)和步驟8)所述的大孔吸附樹脂型號優(yōu)選DlOl型、DA201型。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點:
[0020]1、杜仲葉的植物細胞內(nèi)含有大量的油脂，主要由成分為甘油三酯的化合物組成的混合物，這些油脂以油粒和油體原生質(zhì)體形式、呈不連續(xù)顆粒狀、與顆粒蛋白體一起無規(guī)則地分散在細胞內(nèi)等存在形式存在。現(xiàn)有的提取方法，都是直接對杜仲葉等原料打碎或粉碎后通過水提/醇提、酶解、或者微波提取等方式直接提取，在提取的時候，細胞中的油脂會同時分離出，含有油脂的基團和京尼平甙、京尼平甙酸、色素等成分混在一起，從而影響后續(xù)有效成分的分離，增加了工序的處理難度。本發(fā)明先采用酶提取植物油脂，利用非油成分對油和水的親和力差異及油水比重不同而將油和非油成分分離，增加了產(chǎn)品收率和提高了提取率。
[0021]2、本發(fā)明采用杜仲葉預(yù)濕堆放，加適量水，建堆發(fā)酵，隨著發(fā)酵過程溫度的上升，杜仲葉逐漸軟化，水分自然進入到內(nèi)部，利于植物油脂的分離，利于后續(xù)酶解、去油。
[0022]3、本發(fā)明先采用果膠-纖維素復(fù)合酶去除細胞壁，釋放植物細胞中的油脂，加入甘露醇，可以保持滲透壓，利于油脂的釋放。
[0023]4、采用本發(fā)明的方法，京尼平甙轉(zhuǎn)化率高，在75%以上。
【具體實施方式】
[0024]下面以實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
[0025]實施例1:
[0026]從杜仲葉中提取京尼平的方法，具體包括如下步驟:
[0027]I)預(yù)濕堆放:將杜仲葉在陰涼處建堆，噴水，待水從堆底部流出后，自然堆放12小時；
[0028]2)原料處理:將步驟I)得到的杜仲葉粉碎，加入相當(dāng)于原料2-3倍重量的純凈水，加熱至50°C維持5分鐘，得到膏狀漿液；
[0029]3)第一次酶解:將步驟2)得到的膏狀漿液，調(diào)pH為4，加入膏狀漿液0.05%重量份活性是I萬活性單位/克的果膠-纖維素復(fù)合酶和0.0Ol重量份的甘露醇進行酶解40分鐘，得到第一次酶解液；
[0030]4)去油:將步驟3)得到的第一次酶解液，加入2倍重量的純凈水，加熱至60°C浸提120分鐘，得上層浮油液與下層液、渣混合物，分離；
[0031]5)第二次酶解:將步驟4)得到的下層液、渣混合物，調(diào)pH為4.5，加入相當(dāng)于混合物0.1 %重量份的纖維素酶進行酶解60分鐘，得到第二次酶解液，重復(fù)兩次；
[0032]6)柱層析:合并第二次酶解液，過濾，濃縮，通過柱層析，用DlOl型大孔吸附樹脂進行吸附，用去離子水清洗樹脂至流出液體為無色，再用濃度為20%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；
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