從破壁靈芝孢子粉中提取過氧麥角甾醇的方法
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取過氧麥角留醇的方法，具體涉及一種從破壁靈芝孢子粉中提取過氧麥角留醇的方法，屬于提取分離技術(shù)領(lǐng)域。
【【背景技術(shù)】】
[0002]過氧麥角甾醇，全稱5α ,8α -過氧麥角甾_6，22 (E) - 二烯_3 β -醇(5 α，8 a -Ep id1xyergosta-6, 22-dien_3 β _ol)，為已知化合物，屬于留醇類化合物，廣泛存在于食藥用菌及其他真菌中。關(guān)于其活性報道的很多，專利201410311586.3披露其在殺傷Hela癌細胞方面與紫杉醇具有協(xié)同作用，可降低紫杉醇的用量，從而降低其化療毒副作用和費用；專利200610126091.9公開其具有顯著的抗腫瘤(人乳腺癌及肝癌)的藥理活性，并且對免疫器官和體重沒有不良影響；專利201210233192.1報道其對惡性乳腺癌細胞(MT-1)、淋巴瘤細胞(Jurkat)及腦瘤細胞(U87)均具有顯著的抑制作用，特別是對腦瘤干細胞等耐藥性的腫瘤干細胞具有殺滅作用；專利200810119948.3報道其具有顯著的抑菌活性，可應用于天然抗生素領(lǐng)域；專利01817014.5披露了其具有很強的抑制黑色素生成作用，可應用于美白化妝品領(lǐng)域；專利200610052166.3披露其對農(nóng)業(yè)害蟲，如菜青蟲、斜紋夜蛾、蚜蟲等具有致毒作用，可應用于殺蟲劑領(lǐng)域。另外，還有其他文獻報道其具有抗氧化、抗結(jié)核、抗炎、抗動脈粥樣硬化及抑制人T細胞增殖等廣泛的藥理作用。
[0003]過氧麥角留醇提取分離純化技術(shù)現(xiàn)有文獻報道較少，且多以先分離未知單體后鑒別為過氧麥角留醇為主，極少量文獻資料還存在作者誤判的情況。專利201210233192.1利用酶法破壁孢子粉經(jīng)超臨界二氧化碳萃取，以腫瘤抑制率為活性追蹤手段，先后以氯仿、乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯混合溶劑、石油醚-丙酮混合溶劑等為洗脫劑，經(jīng)3次正向硅膠柱分離，最終再采用制備色譜精制獲得一活性最高的單體成分，鑒別為過氧麥角留醇。專利200610126091.9以簇生沿絲傘子實體或菌絲體為原料，通過甲醇提取，石油醚萃取，上正向硅膠柱，環(huán)己烷-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，合并相同流分，經(jīng)多次重結(jié)晶獲得兩個單體，其中一個鑒別為過氧麥角留醇。專利200810119948.3采用石油醚從真菌Ppf4發(fā)酵菌液中萃取，菌絲用丙酮提取后石油醚萃取，合并石油醚部位，上正向硅膠柱，環(huán)己烷-丙酮混合溶劑洗脫，合并目標流份，再經(jīng)凝膠和反向硅膠精制，獲得三個單體，其中一個鑒別為過氧麥角留醇。程純?nèi)宓?赤芝子實體化學成分研究和細胞毒性測試，沈陽藥科大學學報，2014，31 (2): 102-106.)以赤芝子實體為原料，經(jīng)95 %乙醇提取，石油醚萃取，上正向硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，在一個流份中先重結(jié)晶出另一單體，再將母液進行半制備分離，最終獲得一單體，鑒別為過氧麥角留醇。劉雅峰等(真菌竹黃中的過氧麥角留醇的分離，天津中醫(yī)學院學報，2004，23(1):15-16.)以真菌竹黃為原料，經(jīng)乙酸乙酯提取，以正向硅膠柱反復柱層析獲得一單體，鑒別為過氧麥角留醇。章能勝等(玫煙色擬青霉中過氧麥角留醇的高速逆流色譜法分離純化及質(zhì)譜分析，食品與發(fā)酵工業(yè)，2009, 35(6):14-16.)采用較為先進的高速逆流色譜法對玫煙色擬青霉中過氧麥角甾醇進行分離純化，但其獲得的目標產(chǎn)物并非是真正的過氧麥角留醇，因為過氧麥角留醇在240-400nm無紫外吸收，而文中分離過程的監(jiān)視和目標物的純度檢測均采用280nm紫外吸收波長，且在色譜圖中均顯示出較大的吸光度，可能是作者誤判。
[0004]上述過氧麥角留醇的分離純化技術(shù)均存在一定的共同點:即多先用中強極性有機溶劑提取，弱極性有機溶劑多次萃取除雜后，反復多次經(jīng)正向硅膠柱以一定比例的弱極性有機溶劑洗脫分離，收集目標流份，再經(jīng)凝膠、制備色譜、重結(jié)晶等精制步驟獲得過氧麥角甾醇的單體；其產(chǎn)量多為毫克級，其制備過程多是從未知出發(fā)，即先獲得單體，再鑒定出是過氧麥角留醇，制備目的多是為了闡明天然植物、真菌的化學成分組成，制備流程屬于摸索式分離，工藝過程復雜多變，欠缺對生產(chǎn)成本和得率的考量，整個制備過程中均使用有毒、易揮發(fā)試劑，未考慮環(huán)境安全。終上所述，其工藝不適合直接應用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]模擬移動床色譜分離系統(tǒng)是模擬移動床技術(shù)與色譜分離技術(shù)的有機結(jié)合，它采用系列色譜柱串聯(lián)，并通過電磁閥來實現(xiàn)進料口和出料口的定期連續(xù)切換，以模擬出固定相連續(xù)逆流循環(huán)的移動床效果。模擬移動床技術(shù)與色譜結(jié)合使色譜分離從間歇變?yōu)檫B續(xù)，具有產(chǎn)量大、收率高、純度高的特點，近年來該技術(shù)已被應用于石油化工、食品、發(fā)酵、醫(yī)藥等行業(yè)，主要是石油化工產(chǎn)品、糖、發(fā)酵產(chǎn)物、中藥活性成分、手性化合物的純化。但對于使用模擬移動床技術(shù)純化過氧麥角留醇的方法仍未見公開報道。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡單穩(wěn)定、適合工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)、產(chǎn)品收率較高、生產(chǎn)成本低的從破壁靈芝孢子粉中提取過氧麥角留醇的方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]從破壁靈芝孢子粉中提取過氧麥角甾醇的方法，包括以下步驟:
[0009](I)制備過氧麥角留醇粗提物:采用滲漉法或回流提取法對破壁靈芝孢子粉進行提取，所得提取液減壓濃縮蒸至干，得到過氧麥角留醇粗提物A ;
[0010](2)中壓制備色譜純化:將步驟(I)制得的過氧麥角留醇粗提物A用60-95%甲醇水溶液溶解，制得中壓制備色譜上樣液，進行中壓制備色譜純化，收集含過氧麥角留醇的流份，減壓濃縮至干，得到過氧麥角留醇浸膏B ;
[0011](3)模擬移動床純化:將步驟(2)得到的過氧麥角留醇浸膏B用60-95%甲醇水溶液溶解，制得進樣液，注入模擬移動床色譜分離系統(tǒng)進一步純化，過氧麥角留醇在萃取液中，將萃取液減壓濃縮至干，得到富含過氧麥角留醇的干膏C ;
[0012](4)將步驟(3)中富含過氧麥角甾醇的干膏C用乙酸乙酯-環(huán)己烷混合溶液加熱溶解，轉(zhuǎn)入0-8°C環(huán)境中重結(jié)晶，過濾并洗滌沉淀得到高純度過氧麥角甾醇。
[0013]所述步驟(I)中，滲漉法或回流提取法所用提取溶劑為乙酸乙酯、環(huán)己烷、石油醚中的一種或其任意比例混合物。
[0014]所述步驟(I)中，滲漉法的浸漬時間為24_48h，浸漬溫度為室溫，近似等速收集5-10BV的滲濾液。
[0015]所述步驟(I)中，回流提取法的液固比為6-10，微沸狀態(tài)下提取l_2h，過濾，重復提取1-2次后合并濾液。
[0016]所述步驟⑵中，中壓制備色譜柱采用30-50 μ m ODS硅膠自填，柱高45cm，上樣液的固含量為0.05-0.2g/mL，上樣流速為2_5mL/min，上樣體積為0.1BV，采用60-95%甲醇水溶液以1.2-2.0BV/h的速度等度洗脫。
[0017]所述步驟(3)中，進樣液的固含量為0.05-0.2g/mL，模擬移動床色譜分離系統(tǒng)中色譜柱填料為30-50 μ m粒度的ODS反向硅膠，系統(tǒng)采用8_16支色譜柱串聯(lián)組成，分成四區(qū)，每區(qū)有2-4支相同的色譜柱串聯(lián)，系統(tǒng)參數(shù)設置為室溫，進樣栗流速為3-6mL/min，洗脫栗流速為16-38mL/min，萃取液流速為10-23mL/min，萃余液流速為9_21mL/min，切換時間為 10-24min。
[0018]所述步驟(4)中，乙酸乙酯-環(huán)己烷混合溶液的用量為干膏C的10-20倍，乙酸乙酯與環(huán)己烷的體積比為50:50-10:90，重結(jié)晶的時間為36-48h。
[0019]和現(xiàn)有技術(shù)中過氧麥角留醇的提取方法相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0020](I)本發(fā)明方法中的中壓制備色譜主要起到初步除雜、富集的作用，與現(xiàn)有工藝(低級性有機試劑多次萃取或正向硅膠開放色譜初步切段)相比，不會帶入新的雜質(zhì)和有毒有害物質(zhì)，能很好的保證過氧麥角留醇的天然品質(zhì)，環(huán)境更加安全友好，同時初步去雜效果更好，所獲浸膏中過氧麥角留醇的得率和含量相對較高，雜質(zhì)切割更充分徹底，能基本去除比過氧麥角留醇極性低的雜質(zhì)成分，更適合作為模擬移動床色譜富集工藝的前處理工
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[0021](2)本發(fā)明所采用模擬移動床色譜分離技術(shù)進一步純化，模擬移動床技術(shù)與色譜結(jié)合使色譜分離從間歇變?yōu)檫B續(xù)，而色譜的高分離率、低能耗、低物耗、常溫運行等優(yōu)點繼續(xù)保留。由于模擬了逆流，固定相和流動相能反復利用，從而大大提高了效率，降低了成本；模擬移動床色譜是在譜帶首尾切取流分，使提純過程更易控制；由于引進了精餾、回流機制，使分尚能力增加，廣品收率提尚；又由于引進了連續(xù)機制，大大提尚了廣率，提尚了生廣的自動化水平和效率，溶劑耗損量顯著降低，生產(chǎn)環(huán)境得到極大改善。
[0022](3)本發(fā)明通過初提取、中壓制備色譜純化和模擬移動床色譜純化富集得到的過氧麥角留醇的純度為50-80 %，含量較高。
【【具體實施方式】】
[0023]以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。在未作說明的情況下，本發(fā)明中所涉及到的方法均為常規(guī)方法，所涉及到的原料均為市售產(chǎn)品。
[0024]實施例1:
[0025]采用以下步驟從破壁靈芝孢子粉中提取過氧麥角甾醇:
[0026](I)制備過氧麥角留醇粗提物:采用滲漉法對破壁靈芝孢子粉進行提取，提取溶劑為乙酸乙酯，在室溫條件下浸漬40h，近似等速收集8BV滲濾液；滲濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在水浴溫度65°C，真空度-0.085以下減壓濃縮至干，得到過氧麥角留醇粗提物A，檢測結(jié)果顯示粗提物A中過氧麥角留醇的含量為0.62%。
[0027](2)中壓制備色譜純化:將步驟⑴制得的過氧麥角甾醇粗提物A用60%甲醇水溶液加熱超聲溶解并通過0.45 μ m微孔濾膜，制得固含量為0.05g/mL的中壓制備上樣液，進行中壓制備色譜純化，色譜柱采用50 μ m ODS娃膠自填，柱高45cm，上樣流速為2mL/min，上樣體積為0.1BV，采用60%甲醇水溶液以1.2BV/h的速度等度洗脫，收集含過氧麥角甾醇的流份，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在水浴溫度70°C，真空度-0.085以下減壓濃縮至干，得到過氧麥角甾醇浸膏B。此時，過氧麥角甾醇浸膏B中過氧麥角甾醇的含量為16.8%，極性低的雜質(zhì)成分已基本去除，極性大的雜質(zhì)成分部分去除。
[0028](3)模擬移動床純化:模擬移動床色譜分離系統(tǒng)包括洗脫栗、進樣栗、萃取栗、色譜柱、電磁閥、單向閥、信號采集器、系統(tǒng)控制器等，洗脫栗、萃取栗流速均為0-250mL/min，進樣