合肽A和肽B抑制曲線，計算IC5。值， 試驗結果見表1。
[0032] 表1肽A和肽B的ACE抑制活性結果
[0033]
[0034] 由表 1 可見，肽A的IC50= 67. 52±0. 05yg/mL，肽B的IC50= 43. 18±0. 07yg/ mL，說明肽A和肽B具有較好的ACE抑制活性。
[0035]2、人臍靜脈內(nèi)皮細胞活性試驗
[0036]取對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)，用PBS緩沖液沖洗，棄去PBS緩沖液， 用胰酶溶液消化細胞，制成1X104/mL或1X105/mL的細胞懸液。平行分為11組，具體分組 如下：
[0037] (1)空白對照組；
[0038] (2)肽A低劑量組：加入肽A濃度為150yg/mL;
[0039] (3)肽A中劑量組：加入肽A終濃度為300yg/mL;
[0040] (4)肽A高劑量組：加入肽A肽終濃度為600yg/mL;
[0041 ] (5)肽B低劑量組：加入肽B終濃度為150yg/mL;
[0042] (6)肽B中劑量組：加入肽B終濃度為300yg/mL;
[0043] (7)肽B高劑量組：加入肽B終濃度為600yg/mL;
[0044] ⑶卡托普利（Cap)組：Cap濃度為10 5mol/L;
[0045] (9)去甲腎上腺素（NE)組：加入NE終濃度為100yg/L;
[0046] (10)肽A+NE:加入肽A與NE，肽A濃度為 300yg/mL、NE濃度為 100yg/mL;
[0047] (11)肽B+NE:加入肽B與NE，肽A濃度為 300yg/mL、NE濃度為 100yg/mL。
[0048] ①MIT實驗
[0049] 將1X104/mL細胞懸液，每孔100yL接種于96孔板，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜 置培養(yǎng)。待細胞貼壁后，空白對照組加入l〇〇yL高糖DMEM培養(yǎng)液；試驗組（2)-(11)按分 組要求分別加入同體積的不同干預因素。每組設6個復孔，放入37°C、5%C02條件下分別 培養(yǎng)24、48和72h。培養(yǎng)結束后，每孔加入10yL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄 培養(yǎng)液。每孔加入l〇〇yL的DMS0,震蕩lOmin，使結晶物質(zhì)充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀 在490nm波長處測定其吸光度（A)值，并計算細胞增值率，結果見表2。
[0050] 表2MTT比色法試驗結果
[0051]
[0052] 注：表中數(shù)據(jù)為細胞增殖率，根據(jù)公式細胞增殖率=試驗組0DA49。值/對照組 0DA49。X100 %計算得到；*表示與空白對照組比較P〈0. 05，林表示與空白對照組比較 p<0. 01〇
[0053] 由表2可見，較之空白對照組，NE對HUVEC增殖有明顯的促進作用，而Cap及不同 劑量的肽A、肽B對HUVEC均有抑制生長作用，其中Cap和高劑量肽A和肽B對HUVEC增殖 有極顯著的抑制作用（P〈〇.01)，同時肽A和肽B對NE均具有一定拮抗作用。
[0054] ⑵HUVEC培養(yǎng)液中一氧化氮（N0)和內(nèi)皮素（ET)含量測定
[0055] 將1X105/mL細胞懸液，每孔100yL接種于96孔板，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜 置培養(yǎng)，待細胞貼壁后，按分組要求分別加入不同干預因素，分別繼續(xù)培養(yǎng)1〇、24和48h，收 集培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書測定N0、ET含量，結果見表3和表4。
[0056] 表3細胞培養(yǎng)液中N0含量（yM)測定結果（x±s，n=6)
[0057]
[0058] 注：*表示與空白對照組比較P〈0. 05,**表示與空白對照組比較p〈0. 01。
[0059] 表4細胞培養(yǎng)液中ET含量（pg/mL)測定結果（x±s,n= 6)
[0060]
[0061] 注表示與空白對照組比較P〈0. 05,林表示與空白對照組比較p〈0. 01。
[0062] 由表3、表4可見，與空白對照組比較，卡托普利及不同劑量的肽A、肽B均可升高 HUVEC培養(yǎng)液中N0含量，而且隨著培養(yǎng)時間的延長，N0量顯著增加。而卡托普利及不同劑 量的肽A、肽B對HUVEC培養(yǎng)液中ET的含量，均有顯著的降低作用。
[0063] 實驗結果還顯示，去甲腎上腺素（NE組）可顯著地降低HUVEC培養(yǎng)液中N0含量， 促進ET分泌；中劑量肽A、肽B和去甲腎上腺素合用，可使培養(yǎng)液中NO含量和ET值接近空 白對照組，說明肽A、肽B對去甲腎上腺素具有顯著的拮抗作用。
[0064] 綜合上述實驗結果可見，本發(fā)明所提供的氨基酸序列為Met-His-Thr-Asp-Asp和 Gln-His-Thr-Asp-Asp的兩種扁杏仁肽均具有較高的ACE抑制活性和對人臍靜脈內(nèi)皮細胞 功能的保護作用，因而具有降壓作用，可以作為降壓藥物開發(fā)使用。
【主權項】
1. 具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的扁杏仁肽，其特征在于該扁杏仁肽的氨基酸序列 為：a -His-Thr-Asp-Asp，其中 a 代表 Met 或 Gin。2. -種權利要求1所述的具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的扁杏仁肽的制備方法，其 特征在于它由下述步驟組成： (1) 提取扁杏仁蛋白 將扁杏仁依次經(jīng)熱水脫皮、粉碎、脫脂、溶劑提取、乙醇和等電點沉降法復合沉淀、冷凍 干燥，得到扁杏仁蛋白； (2) 蛋白酶解 將步驟（1)得到的扁杏仁蛋白先用Protamex復合蛋白酶水解，然后用Alcalase堿性 蛋白酶水解，離心分離，上清液冷凍干燥，得到扁杏仁總肽； (3) 葡聚糖凝膠層析 將步驟（2)得到的扁杏仁總肽與超純水按質(zhì)量體積比為30~50g: IL混合，脫氣、超濾 膜過濾后加入Sephadex G-15填充柱中，以超純水為流動相，采用自動液相色譜分離層析儀 進行分離，進樣量2mL，流速3mL/分鐘；收集19~40分鐘所有流出成分，冷凍干燥； (4) 反相制備色譜分離 將步驟（3)冷凍干燥后得到的產(chǎn)品與超純水按質(zhì)量體積比為40~60g: IL混合，用超 濾膜過濾，超聲脫氣后，注射入制備色譜系統(tǒng)，進樣量lmL，采用Sinochrom ODS-BP色譜柱 分離，洗脫相A為乙腈，洗脫相B為含0. 05%三氟乙酸的超純水，梯度洗脫程序：0~10分 鐘，20 %乙腈；10~30分鐘，20 %~40 %乙腈；30~40分鐘，40 %~70 %乙腈；流速12mL/ 分鐘；收集8. 52~9. 14分鐘和14. 87~15. 26分鐘流出的兩種成分，冷凍干燥，得到氨基 酸序列為 Met-His-Thr-Asp-Asp 和 Gln-His-Thr-Asp-Asp 的扁杏仁肽。
【專利摘要】本發(fā)明公開了兩種具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制備方法，其中一種扁杏仁肽的氨基酸序列為Met-His-Thr-Asp-Asp，另一種扁杏仁肽的氨基酸序列為Gln-His-Thr-Asp-Asp。這兩種扁杏仁肽是以扁杏仁為原料，先提取扁杏仁蛋白，將扁杏仁蛋白酶解得到扁杏仁總肽，再經(jīng)葡聚糖凝膠層析、反相制備色譜分離得到。實驗結果表明，這兩種扁杏仁肽具有較高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性，前者對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的IC50值為67.52±0.05μg/mL，后者對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的IC50值為43.18±0.07μg/mL，且細胞毒性較低，因而可以作為降壓藥物。該發(fā)明為扁杏仁的深加工和降壓肽的開發(fā)提供了新途徑。
【IPC分類】C07K7/06, C07K1/34, C07K1/16, C07K1/36, C12P21/06
【公開號】CN105131083
【申請?zhí)枴緾N201510458400
【發(fā)明人】張志琪, 葛先立, 劉瑞林, 蘇娜
【申請人】陜西師范大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年7月30日