一種多氯聯(lián)苯同系物的單克隆抗體的制備及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的制備方法，特別涉及一種水體和土壤沉積物中環(huán)境 激素多氯聯(lián)苯PCB37的免疫檢測的多氯聯(lián)苯同系物的單克隆抗體的制備方法。
【背景技術】
[0002] 多氯聯(lián)苯（PCBs)作為一種具有持久性危害的痕量有機污染物，得到了世界性的 廣泛關注。不同的國家對PCBs的命名的方式不同，除了化學上的標準命名法外，我國習慣 上按聯(lián)苯上被氯取代的個數(shù)（不論其取代位置）將PCBs分為三氯聯(lián)苯（PCB3)、四氯聯(lián)苯 (PCB4)、五氯聯(lián)苯（PCB5)、六氯聯(lián)苯（PCB6)。據(jù)估計，全世界已生產(chǎn)和應用的多氯聯(lián)苯近100 萬t，其在各類環(huán)境中的累積量估計達25萬-30萬t。PCBs具有較低的水溶解性和高的辛 醇-水體系分配系數(shù)，因此很容易就進入生態(tài)循環(huán)，通過食物鏈的被富集，對人類產(chǎn)生毒 害作用。同時由于其化學降解過程和生物降解過程相當緩慢，使得此類物質對環(huán)境造成長 期的污染，以致多次出現(xiàn)二次污染。
[0003] 多氯聯(lián)苯（PCBs)作為一種受到世界各國環(huán)境工作者廣泛關注的環(huán)境激素類污染 物，其檢測方法的研究成為一個研究熱點。當前，以酶聯(lián)免疫法（ELISA)為代表的免疫檢測 方法作為一種快速，特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點，近年來備受人們的關注。美國 國家環(huán)保局（EPA)也已經(jīng)在2003年就把此類方法作為標準方法公布出來，應用于土壤沉積 物中多氯聯(lián)苯的檢測。當前市場上已經(jīng)有多氯聯(lián)苯免疫檢測試劑盒的產(chǎn)品。
[0004] 然而，建立免疫分析方法的關鍵是獲取效價高、選擇性好的抗體。雖然目前已經(jīng)有 關于針對PCB12,PCB37,PCB77的抗體的報導，但它們對目標分子的效價較低，選擇性相對 較差，影響了檢測方法的靈敏度和選擇性。
[0005] 在對環(huán)境中多氯聯(lián)苯PCB37的檢測研究中，對樣品中多氯聯(lián)苯單個有代表性的毒 性較強的單體如PCB37污染物的檢測具有非常重要的意義。雖然目前已建立的酶聯(lián)免疫吸 附分析法、儀器色譜分析能夠準確檢測環(huán)境樣品中的PCBs，但其靈敏度相對較低，對于一些 所含PCBs以痕量存在的樣品，往往需要通過濃縮才能對其實現(xiàn)分析檢測，甚至不能檢出， 從而降低了方法的準確度，不適合環(huán)境中痕量PCBs的分析檢測。但是，2003年，美國西北 大學的ChadMirkin課題組提出了一種超靈敏的基于納米粒子的生物條形碼技術來檢測 蛋白分子，該方法主要通過抗原抗體的特異性結合及磁分離來實現(xiàn)對目標分子的識別和分 離；利用修飾在金納米顆粒（goldnanoparticles，GNPs)表面的DNA作為檢測信號，并將 此DNA形象地稱為條形碼DNA(barcodeDNA)或者信號DNA(signalDNA)。GNPs表面可以 修飾數(shù)百條條形碼DNA，這使得檢測信號得到有效的放大，經(jīng)過金標銀染增強技術進一步放 大信號，用平板掃描儀進行分析檢測，其靈敏度可達10lsmolLi。該方法不用酶標記或者催 化底物放大信號，而單純的用納米材料表面可以修飾大量信號探針的放大效應，并利用純 物理的手段來檢測，這也使得生物條形碼技術成為目前已報導的唯一一種不用酶催化放大 就能和PCR技術相媲美的方法。此外，該方法以DNA作為檢測探針，而現(xiàn)有DNA檢測方法的 多樣化也為生物條形碼技術的發(fā)展和應用提供了廣闊的空間。目前，該方法已成為生物大 分子、環(huán)境污染物等分析檢測方面的研究熱點。
[0006] 此外，近年來，隨著生物條形碼技術與其他分析檢測方法的結合，形成了多種基于 生物條形碼技術的分析方法。其中，熒光定量PCR生物條形碼方法是在體系的檢測階段，以 條形碼DNA為模板DNA，利用實時熒光定量PCR對條形碼DNA進行擴增和分析來定量分析檢 測目標分子；和原有的方法相比，該方法具有更好的特異性，能夠有效的避免與相似蛋白的 交叉反應，以實時熒光定量PCR作為檢測手段也避免了常規(guī)PCR中假陽性的出現(xiàn)。當前，基 于實時熒光定量PCR的間接競爭生物條形碼方法主要用于生物學與醫(yī)學研究領域，用來對 一些致病細菌或蛋白質進行檢測，在環(huán)境監(jiān)測領域，此技術也只是用于對環(huán)境中一些病毒 或蛋白質的檢測。目前還沒見到此技術用于PCBs類尤其是PCB37環(huán)境污染物的檢測報道。
[0007] 現(xiàn)有技術中，專利申請?zhí)枮镃N201310246024. 0,名稱為"一種多氯聯(lián)苯單克隆抗體 的制備方法"，公開了一種多氯聯(lián)苯單克隆抗體的制備方法，但是該方法制備的是混合型單 克隆抗體，其專一性不是很強，容易產(chǎn)生交叉反應，最終導致免疫方法檢測多氯聯(lián)苯時濃度 偏高的現(xiàn)象發(fā)生。

【發(fā)明內容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種抗多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體 的制備方法，該方法制備的單克隆抗體特異性更強，效價更高，提高了抗體對多氯聯(lián)苯單體 的親和性，為滿足多氯聯(lián)苯類污染物的免疫檢測技術發(fā)展的需要提供技術支持。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明提供了一種抗多氯聯(lián)苯單體3, 4, 4'-三氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的制備方 法，所述方法包括以下步驟：
[0011] 通過PCB37半抗原合成免疫原；
[0012] 將合成的免疫原通過采用動物免疫方法及雜交瘤抗體技術制備得到抗多氯聯(lián)苯 PCB37單克隆抗體。
[0013] 優(yōu)選地，所述的通過PCB37半抗原合成免疫原具體包括以下步驟：
[0014] A1、將PCB37半抗原加入非質子有機溶劑a使其溶解，得溶液a;
[0015] A2、將N，N-二環(huán)己基酰亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，加入非質子有機溶劑b使其溶 解，得溶液b;
[0016] A3、將所述溶液b加入所述的溶液a中，攪拌反應；反應完后取上清液；
[0017] A4、將牛血清蛋白BSA溶液加入到所述的上清液中反應，得PCB37半抗原-BSA結 合物，即免疫原。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟A1中，所述PCB37半抗原為三氯聯(lián)苯半抗原，所得溶液a中 PCB37半抗原的濃度為1~3mmol/mL;所述步驟A2中，N,N-二環(huán)己基酰亞胺和N-羥基丁二 酰亞胺的重量比為1:1. 6~1. 8,所得溶液b中N,N-二環(huán)己基酰亞胺的濃度為80~83mg/ mL〇
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟A3中，所述溶液b與溶液a的體積比為3~5 : 4，反應時間為 8~10h;所述步驟A4中，BSA溶液為牛血清蛋白BSA溶于碳酸鹽緩沖溶液所得，BSA溶液 的濃度為16mg/mL，冰浴條件下反應時間為6~8h。
[0020] 優(yōu)選地，所述非質子有機溶液a和非質子有機溶液b獨立地選自N，N-二甲基甲酰 胺或二甲亞砜。
[0021] 優(yōu)選地，所述PCB37半抗原為三氯聯(lián)苯半抗原
熔點為162~164°C。
[0022] 優(yōu)選地，所述的將合成的免疫原通過動物免疫方法及雜交瘤抗體技術制備得到抗 多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體包括以下步驟：
[0023]S1、用已純化的免疫原和完全佐劑混合后充分乳化，然后對動物進行首次免疫注 射，再以不完全佐劑進行追加強化反應，使動物體內產(chǎn)生抗多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體；
[0024]S2、將步驟S1中體內產(chǎn)生抗多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的動物，取其含有抗多氯 聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，獲得含有抗多氯聯(lián)苯PCB37 單克隆抗體的雜交瘤細胞。
[0025] 優(yōu)選地，所述方法還包括采用腹水生產(chǎn)法將步驟S2獲得的雜交瘤細胞接種至動 物腹腔，收集腹水，離心、純化，獲得純化后的抗多氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的步驟。
[0026] 優(yōu)選地，所述純化采用硫酸銨鹽析法、辛酸鹽析法、辛酸-硫酸銨沉淀法、DEAE纖 維素離子交換層析法、QAE纖維素離子交換層析法或親和層析法中的一種或多種結合。
[0027] 優(yōu)選地，所述純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法和DEAE纖維素離子交換層析法結合。 該方法純化效率高，操作簡單，比較適合單克隆抗體的純化。
[0028] 優(yōu)選地，所述方法還包括在步驟S2的細胞融合前三天，對動物進行一次沖刺免 疫。
[0029] 優(yōu)選地，還包括將步驟S2獲得的雜交瘤細胞進行克隆化擴大培養(yǎng)獲得含有抗多 氯聯(lián)苯PCB37單克隆抗體的雜交瘤細胞株的步驟。
[0030] 優(yōu)選地，步驟S1中，所述的首次免疫注射采用等量的免疫原和完全佐劑充分乳 化，免疫原的用量為40~100yg/只。
[0031] 優(yōu)選地，所述的弗氏完全佐劑，包括液體石蠟和羊毛脂的混合物（體積比1~5 : 1)、免疫原和含結核分歧桿菌的細胞壁成分（即卡介苗）；弗氏不完全佐劑，包括液體石蠟 和羊毛脂的混合物（體積比1~5 :1)、免疫原組成的油包水的乳濁液，佐劑活性來自于油 滴中免疫原的持續(xù)釋放，并刺激局部免疫反應。
[0032] 優(yōu)選地，所述動物為哺乳動物或禽類，哺乳動物包括家兔、羊、馬、豚鼠、豬或猴，優(yōu) 選兔或豚鼠；禽類包括雞、鴨、鵝或鶴鶉，優(yōu)選雞；上述動物為適齡、健壯、無感染的動物，優(yōu) 選雄性動物，動物的年齡應是青壯年，優(yōu)選月齡3個月的成年豚鼠。
[0033] 優(yōu)選地，步驟S1中，所述追加強化反應，第一次加強選擇首次免疫后2~3周，以 后的加強選擇上一次免疫后2~4周，所述的追加強化反應所用的免疫原的用量為首次免 疫原用量的〇. 5~1. 5倍。免疫應答需要時間，首次免疫后必須要間隔2~3周給動物一 個適應的過程再加強免疫，防止動物不適應外界刺激而死亡的現(xiàn)象發(fā)生，以后的加強免疫 選擇2~4周的間隔期，也是為了動物體的生物免疫應答不對動物造成過多過大的傷害，如 死亡等。后期的追加強化反應的免疫劑量的選定應考慮抗原性強弱、分子量大小和免疫時 間。抗原需量多，時間間隔長，劑量可適當加大。大動物抗原劑量（以蛋白抗原為準）約 0. 5~lmg/只，小動物約0. 1~0. 6mg/只，豚鼠屬于小動物。擇因為劑量加大極易造成免 疫耐受（免疫抑制）而遭失敗。免疫相關文獻已有證明，幾微克的蛋白質