一種能降低食品中生物胺含量的植物乳桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能降低食品中生物胺含量的植物乳桿菌及其應用，屬于微生物技 術領域。
【背景技術】
[0002] 生物胺（Biogenicamines)是一類主要由氨基酸脫羧或者醛和酮氨基化形成的具 有生物活性的小分子量含氮化合物，是生物體內正常的生理活性物質，在機體細胞活動中 發(fā)揮著重要作用。但當人體外源攝入過量的生物胺時，會導致頭痛，血壓升高，造成人神經 系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)損傷，有時主要是胃腸功能紊亂，造成腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等。而且生 物胺能和亞硝酸鹽反應生成致癌物亞硝類化合物。
[0003] 生物胺是食品中普遍存在的有害物質，尤其是發(fā)酵食品中，食品中的生物胺主要 是由微生物產生，同時也受游離氨基酸含量、溫度、pH值、含鹽量等影響。各類食品中生物 胺的含量不盡相同，對于肉制品和水產品而言，屠宰后的新鮮肉和新鮮的水產品生物胺含 量非常低，但在貯藏過程中會有所上升，而經過發(fā)酵之后得到的香腸或腌制品中生物胺普 遍存在，且部分含量很高；此外，發(fā)酵乳制品中奶酪中生物胺濃度很高，調味品（如魚露、豆 豉、醋等）中有些胺的含量很高，橙汁等果汁類、番茄醬等蔬菜罐頭類和咖啡豆等中也發(fā)現 了生物胺。因為不同生物胺的毒性差別較大，且不同人群對生物胺的解毒能力也相差較大， 建立統(tǒng)一的生物胺限量標準非常困難。美國FDA規(guī)定水產品中的組胺含量不得超過50mg/ kg，并建議酪胺含量不要超過l〇〇mg/kg，生物胺總量不要超過1000mg/kg。
[0004] 生物胺熱穩(wěn)定性好，一般的烹飪過程不能消除食物中的生物胺，現有的控制食品 中生物胺含量的方法主要有以下幾種：1.生產工藝控制：通過對生產過程中的原料、溫度 和鹽度進行合理選擇，抑制生物胺產生菌的生長，以達到抑制生物胺產生的目的，局限性在 于加工溫度和鹽度等因素多由食物特性決定，而低溫貯藏會提高設備和能耗費用，且有些 微生物低溫下也能產生生物胺；2.化學方法：食品添加劑和香料控制，雖然具有一定的生 物胺控制效果，但是食品添加劑成本較高，香料強烈的本體風味會限制其應用范圍；3.物 理方法：超高壓處理，一般針對發(fā)酵前原料或發(fā)酵后產品且可能影響質構，發(fā)酵過程中只能 采用相對低壓，而低壓作用不明顯；4.生物技術：使用不產生生物胺的微生物作為菌粉生 物制劑，令其成為發(fā)酵體系中的優(yōu)勢菌，然后通過營養(yǎng)、空間競爭，改變環(huán)境pH值以及產生 抑菌物質等方式抑制生物胺產生菌的生長，以達到降低生物胺含量的目的。以上方法具有 各自不可避免的局限性，而且均不能降解已經產生的生物胺。尋找降解生物胺的菌作為菌 粉生物制劑可以解決如上問題。目前分離到的具有生物胺降解功能的微生物還存在很多 局限：（1)降解生物胺種類少；（2)降解效果差；（3)安全性存疑等。目前已報道的降解生物 胺的微生物有壁畫鹽單胞菌和釀酒酵母工程菌等，但其用于食品中的安全性有待進一步驗 證，且并非對于常見的8種生物胺都有很好的降解作用；而采用添加單胺氧化酶的方法降 解生物胺不僅成本高，而且可能會對設備有更高的要求。
[0005] 鑒于以上背景，亟需研發(fā)新型的菌粉生物制劑降低生物胺含量。乳酸菌是一類能 使碳水化合物發(fā)酵并產生乳酸的細菌的統(tǒng)稱，廣泛存在于自然發(fā)酵食品中，且一般在發(fā)酵 食品中起主導作用。長期科學研究結果表明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的 具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有：防治乳糖不耐癥、恢復人體腸道內菌群平 衡維護人體健康、抗腫瘤和預防癌癥作用、控制人體內毒素水平、保護肝臟并增強肝臟解毒 功能等?？紤]到乳酸菌具有無二次污染，不損害食品營養(yǎng)，不產生新的毒性物質的優(yōu)點，加 之乳酸菌作為益生菌能在動物體內定植發(fā)揮其多種有益于健康的功效，探索乳酸菌在降低 食品中生物胺的應用具有重大的實用價值。本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCCNo. 9740,分離自四 川內江地區(qū)自然發(fā)酵泡菜，是可用于食品的安全菌株，用于加工制作發(fā)酵類食品的方法具 有工藝簡潔、成本低廉、適用于大規(guī)模工業(yè)化生產等特點。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種植物乳桿菌，分類學命名為植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum)，于2014年09月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 9740。
[0007] 所述植物乳桿菌CGMCCNo. 9740能夠有效降低生物胺含量，來源于四川省內江市 一農家的自制泡菜，其在酸性環(huán)境中具有良好的生長特性。植物乳桿菌在我國《可用于食品 的菌種名單》上，可在食品加工領域中使用，具有良好的市場前景。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種菌粉生物制劑，所述菌粉生物制劑是用植物乳桿 菌CGMCCN0. 9740制備得到的。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種所述菌粉生物制劑的制備方法，是將植物乳桿菌 CGMCCN0. 9740活化后洗滌、離心得到活性菌泥；將菌泥和凍干保護劑按質量比1:10-1:20 混勻，得到菌體濃度在10s-109CFU/mL的植物乳桿菌CGMCCN0. 9740懸浮液，預冷后凍干，即 得到植物乳桿菌CGMCCN0. 9740菌粉菌粉生物制劑。
[0010] 所述制備方法中菌株的活化是多次轉接MRS肉湯培養(yǎng)基。
[0011] 所述制備方法中菌泥是由活化洗滌后的植物乳桿菌CGMCCN0.9740菌液在 6000-8000rpm條件下離心5-lOmin得到的。
[0012] 所述制備方法中凍干保護劑是水與保護劑原料混合制備得到的含有80_120g/L 脫脂奶粉、80-120g/L海藻糖、120-160g/L蔗糖的保護劑。在105°C濕熱滅菌10_15min。
[0013] 所述制備方法中菌體的洗滌是使用無菌生理鹽水進行洗滌。
[0014] 所述制備方法中的凍干是在真空凍干機中凍干。
[0015] 所述凍干是在冷阱溫度-45-55°C、真空度2-6Pa條件下干燥45-50h。
[0016] 所述制備方法得到的菌粉生物制劑中活菌濃度在Kf-K^CFU/g。
[0017] 本發(fā)明的第四個目的是提供所述植物乳桿菌CGMCCNO. 9740的用途，可用于發(fā)酵 乳、泡菜、魚露等發(fā)酵食品的制備。
[0018] 本發(fā)明所提供的植物乳桿菌具有耐酸性，在體外對8種生物胺（色胺、苯乙胺、腐 胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺）具有較強的清除能力，將菌體數為IXK^CFU/mL的植 物乳桿菌與8種生物胺（每種生物胺濃度為100mg/L，總胺濃度為800mg/L)共培養(yǎng)24h， 總胺含量降低近70%，每種生物胺含量降低30% -100%不等，其中對于毒性最大的組胺清 除率達到96. 69% ;同時具有快速產酸能力，8小時即可將pH降到4以下，具有良好發(fā)酵潛 力。本發(fā)明的植物乳桿菌用于降解食品尤其是發(fā)酵食品中的生物胺，具有非常廣泛的應用 前景。
[0019] 生物材料保藏
[0020] 一種植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)，于2014年09月28日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 9740。
【附圖說明】
[0021] 圖1是8種生物胺的高效液相色譜圖。
[0022] 圖2是MRS固體培養(yǎng)基上植物乳桿菌CGMCCN0. 9740的菌落形態(tài)。
[0023] 圖3是40 X 100倍顯微鏡下植物乳桿菌CGMCCN0.9740革蘭氏染色后的形態(tài)。
[0024] 圖4是植物乳桿菌CGMCCN0. 9740在MRS液體培養(yǎng)基中的生長曲線及pH值變化 圖。
【具體實施方式】
[0025] 下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0026] 植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)是從四川內江地區(qū)自然發(fā)酵泡菜中篩選 得到的，菌株編號：CGMCCN0. 9740,植物乳桿菌CGMCCN0. 9740菌落為乳白色，表面光滑濕 潤，邊緣光滑，在MRS肉湯培養(yǎng)基上生長良好。
[0027] 實施例1乳酸菌篩選及保存
[0028] 將取自四川內江地區(qū)的優(yōu)質泡菜的泡菜水用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，選取適 當梯度在添加了 1. 5%的溴甲酚紫溶液（溴甲酚紫溶液濃度為0. 5% )的MRS肉湯培養(yǎng)基 上培養(yǎng)，37°C下培養(yǎng)48h，挑取變色圈大的菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)24小時， 培養(yǎng)溫度37°C。取培養(yǎng)后的菌液lmL至保菌管中，12000rpm，4°C離心2min后取上清，向沉 淀中加入lmL60%甘油重懸，置于-80°C中保存。
[0029] 實施例2植物乳桿菌CGMCCN0. 9740對生物胺降解作用試驗
[0030] 1.植物乳桿菌CGMCCN0. 9740菌種的活化
[0031] 取-20 °C保存的植物乳桿菌CGMCCN0. 9740,將其在MRS平板上劃線培養(yǎng)。在37°C 培養(yǎng)48小時后，從生長良好的植物乳桿菌單菌落上挑取乳酸菌細胞接種到MRS液體培養(yǎng)基 中靜置培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)溫度37°C。
[0032] 2?生物胺標準品母液的配制
[0033] 所述生物胺為生物胺標準品，購于Sigma公司，使用時配制成每種生物胺濃度均 為100mg/L的母液。配置方法為：分別準確稱取0.OlOOrng的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組 胺、酪胺、亞精胺和精胺，溶于l〇〇mL無菌生理鹽水中，充分混勻溶解，并使用0. 22ym有機 微孔濾膜進行過濾除菌后貯存于4°C。
[0034] 3?植物乳桿菌CGMCCN0. 9740菌體的獲取
[0035] 將活化后的菌種按3%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 18小時后離心取菌體，得到的菌體重新懸浮于0. 85%生理鹽水中清洗后再離心獲得植物 乳桿菌菌體，一共清洗3次。得到植物乳桿菌CGMCCNO. 9740菌體。
[0036] 4?植物乳桿菌CGMCCNO. 9740對八種生物胺降解能力的分析
[0037] 取10mL的菌液按上述步驟獲得菌體后與2mL生物胺母液進行混合，使得菌體濃度 達到lXU^CFU/mLA種生物胺的濃度均為100mg/L。將共培養(yǎng)混合物置于37°C培養(yǎng)箱中 靜置培養(yǎng)24h后，于4°C、lOOOOrpm的轉速離心10min取上清液，取lmL上清用丹磺酰氯衍 生，采用高效液相色譜-質譜聯用檢測樣品中8種生物胺的殘留情況。
[0038] 衍生條件：lmL樣品中加入200yL的2mol/L氫氧化鈉溶液，使之呈堿性，然后加 入300yL飽和碳酸氫鈉溶液進行緩沖，再加入lmL丹磺酰氯溶液（10mg/mL丙酮），在黑暗 中置于40°C水浴45min;取出后加入100yL氨水避光放置30min中斷反應并去除多余的丹 磺酰氯；最后用乙腈調整到5mL并用0. 45ym的有機濾膜過濾后待測定。
[0039] 檢測條件：采用的檢測儀器為高效液相色譜-質譜（HPLC-MS)聯用方法，其 中HPLC的型號為Ultimate-3000，MS的型號為QZxactive。HPLC的柱溫為30°C，流速 5. 000yL/s，流動相A為超純水，流動相B為乙腈（色譜純