一株廣譜抗植物致病真菌的芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及芽孢桿菌，尤其是涉及一株廣譜抗植物致病真菌的芽孢桿菌及其在制 備防治植物致病真菌上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋擁有相當(dāng)于陸地將近2. 5倍的面積，蘊(yùn)藏著豐富的生物、化學(xué)資源。海洋生物 由于其生存于高滲、高鹽、低溫、高壓、低氧等特殊環(huán)境，使其能夠在生長(zhǎng)和代謝過程中產(chǎn)生 各種具有特殊生理功能的活性物質(zhì)（高小寧，陳金艷，黃麗麗，等.油菜菌核病內(nèi)生拮抗 細(xì)菌的篩選及防病作用研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010 (2) : 7-10)。在這些海洋生物資源中，豐 富多樣、新奇獨(dú)特的海洋微生物是發(fā)現(xiàn)新材料、新功能、新基因、新機(jī)制的理想資源，近年來 從海洋微生物中不斷發(fā)現(xiàn)具有生理意義的新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這類物質(zhì)通常具有陸地微生 物所沒有的新的獨(dú)特結(jié)構(gòu)（張傯，張長(zhǎng)生，田新朋，等.中國(guó)海洋微生物多樣性研究[J]. 中國(guó)科學(xué)院院刊，2010(6) : 651-658)。
[0003] 由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病是油菜生產(chǎn)中的重要 病害，致油菜減產(chǎn)10 %~70 %，含油量降低1 %~5 %，嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。噴 灑化學(xué)藥劑仍是目前防治油菜菌核病最直接、簡(jiǎn)便的方法，同時(shí)也是最有效的防治方法。 但長(zhǎng)期單一使用同種化學(xué)藥劑，使病原菌對(duì)化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗藥性，防效逐年下降。近年 來，人們逐漸將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了生物防治（Panlilio A L，Culver D H，Gaynes R P，et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in US hospitals, 1975 - 1991[J]. Infection Control, 1992, 13(10) :582-586)。生物農(nóng)藥對(duì)空氣、水源、土壤和農(nóng)作物的無污 染性，使其成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向。
[0004] 已經(jīng)報(bào)道的芽孢桿菌菌株對(duì)不同植物的病原真菌和細(xì)菌具有防治作用，如糧食作 物中的水稻紋枯病、稻瘟病、小麥紋枯病、豆類根腐病及小麥全蝕病等，蔬菜病害中的番茄 葉霉病、黃瓜枯萎病、黃瓜霜霉病、茄子灰霉病及辣椒疫病等（程亮，游春平，肖愛萍.拮 抗細(xì)菌的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004, 25 (5) : 732-737)。芽孢桿菌具有生長(zhǎng)快、 營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、易分離培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)（朱玥妍，劉姣，杜春梅.芽孢桿菌生物防治植物 病害研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013, 40 (34) : 16635-16638)，更符合現(xiàn)代社會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)及有害生物綜合防治的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一株廣譜抗植物致病真菌的芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-014。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供所述廣譜抗植物致病真菌的芽孢桿菌（Bacillus sp. ) DY26-014在制備防治植物致病真菌發(fā)酵上清液中的應(yīng)用。
[0007] 所述芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26_014分離自中國(guó)大洋第26次科學(xué)考查所采集 的沉積泥樣品（S003站點(diǎn)；w63° 45. 3496'，S3。39. 8693');該菌已于2015年6月27 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國(guó)，武漢，武漢大 學(xué)，郵編為430072,保藏中心保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2015408。
[0008] 所述芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-014通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增其16S ri)NA序列，與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)的序列進(jìn)行比對(duì) 分析，發(fā)現(xiàn)其與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.)具有99%的序列相似性；16S ri)NA序列的 GenBank 登錄號(hào)為 KT270354。
[0009] 所述芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26_014的16S rDNA部分序列如下：
[0010] I TCAGAGCTTG C'TC，C(T^ SI TAAC(:TG(:CT OTAAGACTGG GAT八八CTCCW I () I GAT(.K.iTT(.iTC T(."VAC(、GCAT GGTTC八(::A 151 CACTTACAGA TGGACraK/G 201 CA(，CA ACKK，G ACGATGCGTA Ga M ：251 GGACTGAGAC ACGGCCCAGA CTCCmCGGG AGGCAGCAQT AGGGAAICTT 301 rC'GC、八AT(.K.;A C(.i八八八(.iTCTCi AC( AAGCAAC (f 351 TTTCCK-iATC'G T八八八(XTCTG爪 401 AG(.K;】a.K.K'AC CriX込C(.K.n'A CCTAACC'AG八八八(:（ 45] a 'A(XA(.K:、CG CG(.n7\ATAr(.r「A(.K.;T(.KX八八 501 G(:GTA八八CK又i CTCVjCA(-K:iCM 551 CTC八八CC(K(iA(.K.KTT CATT (K.i八八八CT(KG八八C'TT(.iA(.iT GCAGAAG八(.iG 601 AGAGTCK-L'AT TCCA(XiTGTA (S5I ACCAGTGGC'G八八GGCGAC'TC' TCTGCHCT(幾
[0011] 701 AGCGTGGGGA GCQMCAGGA TmG^CCC TOGmGTCCA CGCCGmAAC 751 GAT(.L\(:,T(.K'_T八八(」TGTTA(.K.i GGGTTT(:TGC C(:TTT^ HOI GCATT八八GCA CTCCGCCRiCi C.iC.iAGTACGGT. C(.X 851 (^『I'CiACGG (.K.K.KXCGCAC、A A(.K:、 901 CA ACGCGA八(.；A ACCTTACCA G(iTCTT(x\rA T(XTCT(iAC八八TC('T八GAG八 951 TAGGA(X CCTTCG(.;(.K.K.KV\GA(.;TGA('八（iGTGGTGQ 1001 AGCTCXiTGTC' CiTGACiATGTT GGGTTAAGTC' C'CCiCAACGAC, CXiCAACC'CTT 1051 GATCTTACiTT GCCAGCATTC A(.iTT(.i(.K.;CAC TCTAAGGT(.iA CT(.iC'C(.i(幾 11 () I CAAACCGGAG GAAGGTCiGGG AT(W 1151 CTGGGCTACA CACGTGCTAC八 1201 GAGGTT八八GC C、AATCC、CAC八八八lX、TC;m、T CA(汀TCGGAT CGCAGTCTCiC 1251 A ,\(:、T(:、GACT(j C(.】T(.;AAGC'TG GAATC(.K.:TA(.H.AATCGCCKj^^^ 1301 (XTK-'iTGAATA CGTTC(T(:>(:>(W 1351 A(jT'TT(iTAAC'AC'CT'GAAGTC' CiCiTGAC.K.n'A.
[0012] 所述芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-014可在制備防治植物致病真菌發(fā)酵上清液 中的應(yīng)用。
[0013] 所述植物致病真菌包括但不限于鐮刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長(zhǎng)柄 鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌、互生鏈格孢、灰霉菌和膠孢炭疽菌。其對(duì)油菜菌核病菌（核 盤菌）具有較好的生物防治效果，在盆栽試驗(yàn)中，防效可達(dá)到61. 9%。
[0014] 所述防治植物致病真菌發(fā)酵上清液的使用方法可為：將防治植物致病真菌發(fā)酵上 清液直接噴灑在植物上即可用于致病真菌的防治。
[0015] 所述防治植物致病真菌發(fā)酵上清液的制備方法如下：
[0016] 將芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-014接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)后，離心除去 菌體，即得防治植物致病真菌發(fā)酵上清液。
[0017] 所述芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-014的接種量按質(zhì)量百分比可為發(fā)酵培養(yǎng)基 的1 %~10%;所述搖床培養(yǎng)的條件可為：發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為500mL/lL三角瓶，培養(yǎng)的溫 度25~30°C，培養(yǎng)的時(shí)間48~72h，搖床轉(zhuǎn)速為180~220r/min。
[0018] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可為：氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， 121°C高滅壓菌20min ;所述離心除去菌體的條件可在10000r/min下離心15~20min。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26_014發(fā)酵 上清液的制備工藝簡(jiǎn)單，抑真菌譜廣，對(duì)核盤菌生防效果好。
【附圖說明】
[0020] 圖1為芽抱桿菌（Bacillus sp.)DY26-014的菌落形態(tài)。
[0021] 圖2為芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-014發(fā)酵上清液對(duì)不同植物致病真菌的抑 菌效果圖。在圖2中：A :灰霉菌；B :宛氏擬青霉；C :核盤菌；D :綠色木霉；E :立枯絲核菌； F :長(zhǎng)柄鏈格孢；G :膠孢炭疽菌；h :互生鏈格孢；I :鐮刀菌；J :香蕉炭疽菌。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0023] 實(shí)施例1:芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26_014的分離篩選
[0024] 本發(fā)明涉及芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-014來源于從中國(guó)第26次大洋科學(xué)考 查所采集的沉積泥樣品中所分離獲得。該菌在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，28°C培養(yǎng)24h后，菌體呈 淺黃色，菌落較大，生長(zhǎng)初期菌落呈水滴狀，見圖1。
[0025] 實(shí)施例2 :芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26_014菌種鑒定
[0026] 設(shè)計(jì)并合成16s rDNA基因的通用正向引物27F和通用反向引物1492R，