一種腸球菌y12及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種菌株，特別是，一種腸球菌5A )Y12,本發(fā)明還公 開了該菌株的用途。
【背景技術】
[0002] 水體富營養(yǎng)化是指在人類活動的影響下，大量氮、磷等富營養(yǎng)物質進入養(yǎng)殖池、湖 泊、淺海等緩流水體，使得藻類等浮游生物爆發(fā)性繁殖，迅速消耗水體溶解氧，引起水質惡 化，導致魚類、蝦蟹等水生生物大量死亡的現(xiàn)象。同時，由于水體的富營養(yǎng)化，水底堆積的有 機物質被厭氧微生物分解產生有害氣體以及一些浮游生物產生生物毒素，都對水產養(yǎng)殖動 物產生重大威脅。因此，對于水產養(yǎng)殖業(yè)來說，水體富營養(yǎng)化是制約其發(fā)展的關鍵性問題。 而水產養(yǎng)殖業(yè)由于工廠集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，為追求經濟效益，各養(yǎng)殖場常濫施藥物以 及大量使用人工飼料，導致養(yǎng)殖水體中經常出現(xiàn)氨氮污染現(xiàn)象，而氨氮污染是水體富營養(yǎng) 化的主要原因之一。
[0003] 近幾年頻繁發(fā)生的養(yǎng)殖水體氨氮污染事件，給水產養(yǎng)殖業(yè)，特別是海水養(yǎng)殖業(yè)帶 來了嚴重的經濟損失。因此對養(yǎng)殖水體中氨氮濃度的控制以及如何高效地解決養(yǎng)殖水體中 氨氮污染的問題，對水產養(yǎng)殖的發(fā)展有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種新的腸球菌 (i^terococci/6 1 5A )Y12,該菌株為一種高效降氮的氨氧化細菌，可以用于海水養(yǎng)殖池廢 水處理，優(yōu)化海水養(yǎng)殖環(huán)境。
[0005] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供了腸球菌（辦5A )Y12的 用途。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種腸球 菌（汾耶.）Y12,其特點是，其保藏號為CCTCCNo:M2015474。 本發(fā)明菌株腸球菌（汾) Y12 (以下簡稱腸球菌Y12或者Y12)為從海 水養(yǎng)殖池底泥樣品中通過富集、分離出氨氧化細菌，模擬海水養(yǎng)殖廢水篩選，獲得高效降氮 的氨氧化細菌。該菌株已于2015年7月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏 編號為CCTCC No :M2015474 ;保藏單位地址：武漢市武漢大學，電話：027-68754052,郵編： 430072。
[0007] 本發(fā)明所述的腸球菌Y12,其優(yōu)選的保藏方法為：將菌株接入含3% NaCl的LB培 養(yǎng)基，在28°C，180 rpm下培養(yǎng)24 h，得發(fā)酵液；取1. 5 mL離心管，按1:1的比例將發(fā)酵液 與滅過菌的30 %甘油混合裝入其中，顛倒數(shù)次混勻后放入-40 °C冰箱保存。
[0008] 本發(fā)明所述的腸球菌Y12,其分離篩選方法如下： (1)富集：采集蝦蟹貝混養(yǎng)池底泥5 g，轉入裝有100 mL已滅菌的氨氧化細菌富集培養(yǎng) 基500 mL三角瓶，再加入十多粒玻璃珠，在28°C，180 rpm培養(yǎng)3 d后，用移液器吸取5 mL移 入含有100 mL新鮮富集培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，再富集3 d;依次類推，共富集三次；得 富集液；氨氧化細菌富集培養(yǎng)基的配方是：胰蛋白胨5.0 g，MgS04*7H20 0. 5 g，F(xiàn)eS04*7H20 0? 1 g，KC1 0? 3 g，陳海水 1000 mL，pH 7. 2 ; (2) 分離純化：取1 mL上述富集液轉入裝有9 mL無菌水的試管中，混勻，按10 \ 10 2、 10 3、10 4、10 5、10 6 6個梯度稀釋；分別吸取0.1 mL涂布于氨氧化細菌分離培養(yǎng)基上并標 記；分離培養(yǎng)基是在富集培養(yǎng)基基礎上多加其質量的2%的瓊脂；將已涂布的平板于28°C下 培養(yǎng)48 h ;待菌落可用肉眼明顯辨別時，借助放大鏡仔細挑選出顏色、形態(tài)等特征有差異的 單菌落，然后進行三區(qū)劃線，于28°C下培養(yǎng)48 h ;重復三區(qū)劃線分離單菌落直至得到純培 養(yǎng)物 13 個菌株，分別編號為 Yl，Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Yll，Y12, Y13; (3) 篩選： 氨氧化細菌篩選培養(yǎng)基：葡萄糖 5. 0 g，（NH4)2S04 0? 25 g，K2HP04 0? 5 g，MgS04 ? 7H20 0? 25 g，陳海水 1000 mL，pH 7. 2; 參照GB17378. 4-2007次溴酸鹽氧化法測定氨氮含量；制備100 mg/L (NH4)2S04標準貯 備溶液，稀釋測定各標準（冊14)2304濃度下的A 543，以（NH4)2S(V^度為橫坐標，A 543為縱坐標 制作標準曲線； 在含50 mL氨氧化細菌篩選培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，分別接入所述的13個菌株，每 種菌株接種3瓶，28°C，180 rpm培養(yǎng)36 h;分別取樣10 mL，在8000 rpm離心3 min，測定 上清液A543，并根據(jù)標準曲線計算氨氮含量，按下列公式計算氨氮降解率： 氨氮降解率(％)=(起始氨氮含量-降解后氨氮含量）/起始氨氮含量X 100 篩選得到對氨氮的降解能力最強的菌株Y12。
[0009] 本發(fā)明所述的腸球菌（iiterococciAs 5/7. )Y12可以用于海水養(yǎng)殖池廢水氨氮降解 處理。該菌株為一種高效降氮的氨氧化細菌，可以用于海水養(yǎng)殖池廢水處理，優(yōu)化海水養(yǎng)殖 環(huán)境。
【附圖說明】
[0010] 圖1為氨氮測定的標準曲線圖； 圖2為不同菌株對培養(yǎng)基中氨氮的降解率柱形圖； 圖3 - 4為菌株Y12的形態(tài)特征圖； 圖5為菌株Y12 16S rDNA擴增圖； 圖6為菌株Y12系統(tǒng)發(fā)育樹； 圖7為菌株Y12的生長曲線及各生長時期的氨氮含量曲線圖。
【具體實施方式】
[0011] 以下參照附圖，進一步描述本發(fā)明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進 一步地理解本發(fā)明，而不構成對其權利的限制。
[0012] 實施例 1，一種腸球菌（及耶.）Y12 :其保藏號為 CCTCC No :M2015474。
[0013] 實施例2,實施例1所述的腸球菌Y12的分離篩選、保存與用途實驗： 1. Y12菌株的分離篩選及保存 1. 1氨氧化細菌的富集 在連云港市贛榆縣某蝦蟹貝混養(yǎng)池采集底泥5 g，轉入裝有100 mL已滅菌的氨氧化細 菌富集培養(yǎng)基500 mL三角瓶，再加入十幾粒玻璃珠，在28°C，180 rpm培養(yǎng)3 d后，用移液器 吸取5 mL移入含有100 mL新鮮富集培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，再富集3 d。依次類推，共 富集三次。氨氧化細菌富集培養(yǎng)基的配方是胰蛋白胨5.0 g，MgS04*7H20 0. 5 g，F(xiàn)eS04*7H20 0? 1 g，KC1 0? 3 g，陳海水 1000 mL，pH 7. 2。
[0014] 1. 2氨氧化細菌的分離純化 取1 mL上述富集液轉入裝有9 mL無菌水的試管中，混勾，按10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、 10 6 6個梯度稀釋。分別吸取0. 1 mL涂布于氨氧化細菌分離培養(yǎng)基上并標記。分離培養(yǎng)基 是在富集培養(yǎng)基基礎上多加2%的瓊脂。將已涂布的平板于28°C下培養(yǎng)48 h。待菌落可用 肉眼明顯辨別時，借助放大鏡仔細挑選出顏色、形態(tài)等特征有差異的單菌落，然后進行三區(qū) 劃線，于28°C下培養(yǎng)48 h。重復三區(qū)劃線分離單菌落直至得到純培養(yǎng)物。本次得到13個 菌株，分別編號為Y1，Y2, Y3，……Y13。
[0015] 1.3菌種保藏 將純化的單菌落接入含3% NaCl的LB培養(yǎng)基，在28°C，180 rpm下培養(yǎng)24 h。取1. 5 mL離心管3-5支，按1:1的比例將發(fā)酵液與滅過菌的30 %甘油混合裝入其中，顛倒數(shù)次混 勻后放入-40 °C冰箱保存。
[0016] 氨氧化細菌的篩選 氨氧化細菌篩選培養(yǎng)基：葡萄糖 5. 0 g，（NH4)2S04 0? 25 g，K2HP04 0? 5 g，MgS04 ? 7H20 0? 25 g，陳海水 1000 mL，pH 7. 2。
[0017] 2. 1氨態(tài)氮測定標準曲線的制作 參照GB17378.4-2007次溴酸鹽氧化法測定氨