利用對蝦病毒ihhnv病毒樣顆粒包裹特異雙鏈rna的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒，尤其是涉及利用對蝦病毒 IHHNV病毒樣顆粒包裹特異雙鏈RNA的方法。
【背景技術】
[0002] 對奸傳染性皮下及造血組織壞死病毒（infectioushypodermaland hematopoieticnecrosisvirus，IHHNV)是世界各地養(yǎng)殖和野生對奸的重要病原 之一，是已知最小的對奸病毒，隸屬于細小病毒科（Parvoviridae)短濃核癥病毒屬 (Brevidensovirus)。該病毒分布廣泛，對細腳濱對奸有較高致病性和死亡率（90% )， 對已被廣泛養(yǎng)殖的凡納濱對奸可導致慢性矮小殘缺綜合癥（runt-deformitysyndrome， RDS)，使生長畸形，造成較大經(jīng)濟損失。IHHNV的病毒粒子直徑約22nm，是無囊膜包被 的二十面體，其基因組是線性單鏈DNA，長度為4.lkb，由三個開放閱讀框和兩末端的非 編碼序列構成，預計三個0RF分別編碼非結構蛋白l(nonstructuralprotein1，NS1), 非結構蛋白 2(nonstructuralprotein2,NS2)和衣殼蛋白（capsidprotein,CP) (1、 BonamiJR,TrumperB,MariJ,BrehelinM,andLightnerDV. (1990).Purificationand characterizationoftheinfectioushypodermalandhaematopoieticnecrosis virusofpenaeidshrimps.JGenVirol71(Pt11) : 2657-2664 ;2、ShikeH,Dhar AK,BurnsJC,ShimizuC,JoussetFX,KlimpelKR,andBergoinM. (2000).Infectious hypodermalandhematopoieticnecrosisvirusofshrimpisrelatedtomosquito brevidensoviruses.Virology277(1) : 167-177)。2008 年，本申請人對對奸傳染性皮下及 造血組織壞死病毒（中國福建株）全基因組進行了測定（GenBankAcc.EF633688) (3、吳昊， 徐麗美，楊豐.（2000).對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（福建株）基因組的克隆.臺 灣海峽27:147-151)，此前雖然在中國大陸大部分地區(qū)均發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖對蝦感染IHHNV(4、Yang B,SongXL,HuangJ,ShiCY,andLiuL. (2007).Evidenceofexistenceofinfectious hypodermalandhematopoieticnecrosisvirusinpenaeidshrimpculturedin China.VetMicrobiol120 (1-2) : 63-70)，但并未見其基因組序列報道。序列測定顯示該病 毒基因組全長3833bp，DNAMAN5. 0軟件分析發(fā)現(xiàn)有三個較大的0RF位于正鏈DNA中，其中 0RF3起始于2521nt，結束于3510nt，編碼的蛋白約有329個氨基酸，分子量為37kDa，預測 其產(chǎn)物為衣殼蛋白。
[0003] 近年來，許多種病毒的衣殼蛋白基因都能在原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、 植物表達系統(tǒng)以及昆蟲表達系統(tǒng)中表達，并且自組裝成病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLPs)。絕大多數(shù)VLPs的構建選擇的都是真核細胞表達系統(tǒng)，使用原核表達 系統(tǒng)的較少，主要是由于原核表達系統(tǒng)不能對蛋白進行必要的修飾，不利于VLPs的形成。 但是原核系統(tǒng)以其操作方便、表達高效、易于純化等優(yōu)點受到廣泛應用。研究表明，原核 細胞中表達人乳頭瘤病毒HPV16(Humanpapillomavirus16，HPV16)的L1蛋白可高效地 組裝成VLPs。HPV16型L1蛋白在鼠傷寒沙門氏菌中表達，可獲得VLPs，結構與天然HPV 類似，首次證實HPVL1蛋白能夠在原核細胞中自行組裝成VLPs(5、Nardelli-Haefliger D，RodenRB，BenyacoubJ,SahliR，KraehenbuhlJP，SchillerJT，LachatP，PottsA，and DeGrandiP. (1997).Humanpapillomavirustype16virus-likeparticlesexpressed inattenuatedSalmonellatyphimuriumelicitmucosalandsystemicneutralizing antibodiesinmice.InfectAndImmun65(8) :3328_3336)dChuanYP等對宿主株系、表 達質粒、誘導劑濃度、培養(yǎng)條件進行了篩選與優(yōu)化，通過低密度大腸桿菌高水平表達形成 VLPs的可溶性結構蛋白，使表達水平達到了 180mg/L(6、ChuanYP，LuaLH，andMiddelberg AP. (2008).High-levelexpressionofsolubleviralstructuralproteinin Escherichiacoli.JBiotechnoll34(l-2):64-71)c3目前，通過利用昆蟲桿狀病毒表達載 體，許多細小病毒的衣殼蛋白都可以在昆蟲細胞中表達并自組裝成病毒樣顆粒。腺聯(lián)病毒 (adeno-associatedvirus，AAV)、B19病毒（humanparvovirusB19)、豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV)、鼠細小病毒（parvovirusminutevirusofmice，PMVM)和犬細小病毒 (canineparvovirus，CPV)的衣殼蛋白都已經(jīng)在昆蟲細胞中被成功表達且自組裝成VLPs。 但是還沒有關于細小病毒衣殼蛋白能在原核表達系統(tǒng)中表達并自組裝成VLPs的報道。
[0004] 與天然病毒粒子相比，病毒樣顆粒保持了天然病毒所具有的均一性，細胞取向性， 與病毒受體定向結合性，并且在細胞內部的運輸機制也與天然病毒相似。此外，由于病毒樣 顆粒不攜帶病毒自身的遺傳物質，不能自行復制，所以不存在感染性。但正是由于此，病毒 樣顆粒可用于某些治療目的的載體系統(tǒng)，運輸核酸、蛋白、小分子物質或某些藥物。在治療 性疫苗的研究中，選擇高效、安全、特異的載體系統(tǒng)很關鍵。病毒衣殼蛋白一般具有堿性多 肽域，這些堿性多肽域朝向顆粒的內表面，由于核酸的磷酸基團骨架呈負電荷，二者之間能 形成一種高親和性、非特異性的相互作用力。類似地，核酸以外的其它分子，只要帶有合適 的電荷，都能被包裹入VLPs中或結合于其表面（7、PetryH，ColdmannC，Ast0，andLuke ff. (2003).Theuseofvirus-likeparticlesforgeneTransfer.CurrOpinMolTher 5(5) :524-528)，因此，VLPs可作為基因或藥物轉移的載體。并且由于VLPs的空間阻隔作 用，內部的核酸分子能有效地受到保護，不會遭到核酶的破壞。
[0005] 鑒于VLPs與天然病毒結構的相似性、不感染宿主的安全性、良好的結構穩(wěn)定性、 出色的免疫原性，以及良好的結構可塑性、獨特的承載DNA及其它分子的能力，VLPs相關技 術在生物醫(yī)學基礎研究、新型疫苗開發(fā)、新型藥物遞送載體開發(fā)及基因治療中具有廣闊的 應用開發(fā)前景。已有研究表明，有些VLPs能攜帶外源核酸物質、蛋白質、藥物或者其他小 分子物質而被當作載體成為疾病治療及預防的手段之一（8、LorenzoLJ，Duenas-Carrera S，F(xiàn)alconV,Acosta-RiveroN，GonzalezE，delaRosaMC，MenendezI，andMorales J. (2001).AssemblyoftruncatedHCVcoreantigenintovirus-likeparticlesin Escherichiacoli.BiochemBiophysResCommun281(4)，962-965 ;9、SedlikC，Saron M，SarrasecaJ，CasalI，andLeclercC. (1997).Recombinantparvovirus-1ike particlesasanantigencarrier:anovelnonreplicativeexogenousantigen toelicitprotectiveantiviralcytotoxicTcells.ProcNatlAcadSciUS A94 (14):7503-7508 ；10>BraunH,BoilerK,LowerJ,BertlingWM,andZimmerA. (1999). OligonucleotideandplasmidDNApackagingintopolyomaVPlvirus-likeparticles expressedinEscherichiacoli.Biotechno1ApplBiochem29(Ptl):31_43)〇
[0006] 由于VLP的免疫原性和非感染性，目前有許多哺乳動物病毒的VLP被研究用于疫 苗研制，如人丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、豬水皰病病毒。但是與其他的無脊椎動物一樣， 蝦缺乏典型的脊椎動物獲得性免疫系統(tǒng)，包括免疫球蛋白，T/B細胞受體和主要組織相容性 復合體。所以，要研究一種抗病毒感染的疫苗是很難的。但是，這種抗體反應的缺乏對于將 病毒樣顆粒用于在無脊椎動物中的藥物運輸和基因療法可能是一種優(yōu)勢。由于對蝦不會產(chǎn) 生中和抗體對病毒樣顆粒進行免疫清除，病毒樣顆?？梢员欢啻问褂谩?br>[0007] 對奸白斑綜合癥病毒（Whites