一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量的 方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆（Glycine max)是世界上重要的油料糧食作物，其種子油是人類(lèi)與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng) 以及食品加工業(yè)植物食用油的重要來(lái)源。大豆油用量占全世界食用油的31% (Kim and Krishnan，2004)。大豆種子油主要是由甘油和脂肪酸組成的，其中脂肪酸占種子油的90% 以上，主要包括棕櫚酸（16:0)與硬脂酸（18:0)兩種飽和脂肪酸和油酸（18:1)、亞油酸 (18:2)與亞麻酸（18:3)等三種不飽和脂肪酸。脂肪酸的組成及其種類(lèi)配比決定了種子油 的品質(zhì)。棕櫚酸是飽和脂肪酸，不易消化吸收，人類(lèi)過(guò)度食用，會(huì)造成肥胖和心血管疾病，降 低大豆棕櫚酸含量可以增加大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
[0003] 由于棕櫚酸含量是受多基因控制的數(shù)量性狀且易受環(huán)境影響，利用傳統(tǒng)表型鑒 定和育種方法培育低棕櫚酸含量的品種不但需要花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間，而且難于成功，已經(jīng) 不能夠滿足當(dāng)前優(yōu)質(zhì)大豆育種的發(fā)展。隨著分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和使用，分子標(biāo)記輔助選擇 (Molecular marker-assisted selection，MAS)成為可以節(jié)約人力、物力和加速育種進(jìn)程 的有效方法（Cregan et al. 1999)。分子標(biāo)記輔助選擇的最大優(yōu)點(diǎn)為在不需要評(píng)估表型特 征的情況下，通過(guò)確認(rèn)是否帶有目標(biāo)基因而鑒定出低棕櫚酸含量的植株。
[0004] 大豆種質(zhì)資源中蘊(yùn)藏著豐富的基因，從育種的物質(zhì)基礎(chǔ)一種質(zhì)資源中發(fā)掘所需要 的優(yōu)異資源及基因可有效促進(jìn)大豆品種改良。作為栽培大豆起源地，我國(guó)的大豆種質(zhì)資源 在世界上最為豐富，現(xiàn)保存在國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)的就有3萬(wàn)余份，在棕櫚酸含量上變異廣泛 (劉興媛等，作物品種資源，1998)。為了有效的研究和利用我國(guó)大豆資源，邱麗娟等（作物 學(xué)報(bào)，2009)構(gòu)建了可代表我國(guó)大豆種質(zhì)資源多樣性的核心種質(zhì)，為深入發(fā)掘種質(zhì)資源中蘊(yùn) 藏的優(yōu)異基因、有效拓寬大豆遺傳基礎(chǔ)奠定了材料基礎(chǔ)。
[0005] 關(guān)聯(lián)分析，又稱關(guān)聯(lián)作圖（Association Mapping)，是一種以LD (Linkage Disequlibrium)分析為基礎(chǔ)，直接對(duì)基因型變異和表型變異進(jìn)行分析，從而把那些與性狀 有關(guān)聯(lián)的基因鑒定出來(lái)（Khush et al. 2001)的基因定位方法，已成為發(fā)掘與表型相關(guān)分 子標(biāo)記的強(qiáng)有力工具。新型分子標(biāo)記一SNP因?yàn)榫哂性诨蚪M中數(shù)量多、分布廣泛、可高 通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而在近年廣泛用于鑒定多基因控制的復(fù)雜性狀。隨著SNP標(biāo)記數(shù)量的不 斷增多，高通量的SNP分型平臺(tái)相繼推出，包括Goladen Gate和BeadArray (Illumina)， GenomeLab SNP stream(Beckman)和 MegAllele(AfTymetrix)等，其中 Illumina 公司的 BeadArray芯片鑒定技術(shù)具有高效、高通量、成本低、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，適合位點(diǎn)數(shù)從幾十到 幾千的中等通量基因分型研究，實(shí)驗(yàn)成功率>99%，是理想的中高通量基因分型檢測(cè)的解決 方案，目前已被廣泛用于人類(lèi)、擬南芥、水稻等物種的SNP分型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀，和/或，篩選或輔助 篩選具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含 量性狀的方法，可包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基因型， 如果為T(mén)T純合型、待測(cè)大豆籽粒為候選的具有低棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒，如果為CC純 合型、待測(cè)大豆籽粒為候選的具有高棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種篩選或輔助篩選具有不同棕櫚酸含量 的大豆籽粒的方法，可包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基 因型，如果為T(mén)T純合型、待測(cè)大豆籽粒為候選的具有低棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒，如果 為CC純合型、待測(cè)大豆籽粒為候選的具有高棕櫚酸含量性狀的大豆籽粒。
[0009] 上述方法中，所述Map-6064位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第5條染色體的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6064位點(diǎn)為序列表中序列1的第891位。
[0010] 上述方法中，所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3% ;所述高棕櫚酸含 量指的是棕櫚酸含量可為12. 3%以上。
[0011] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基因型的方法 可包括：（1)提取大豆基因組DNA。（2)加入Map-6064探針組，進(jìn)行等位基因特異性延伸和 連接酶連接，可以得到一段包含Map-6064SNP位點(diǎn)和地址序列的片段。（3)將得到的片段進(jìn) 行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增體系中具有Cy3標(biāo)記的dATP、Cy5標(biāo)記的dGTP、dCTP和dTTP)后與芯片 (美國(guó)11 lumina公司產(chǎn)品，芯片上具有微珠，微珠表面連接有所述地址序列的互補(bǔ)序列）進(jìn) 行雜交。（4)芯片掃描，利用軟件根據(jù)兩種熒光顏色判讀并輸出分型結(jié)果。從而確定待測(cè)大 豆品種基于Map-6064SNP位點(diǎn)基因型為CC純合型或TT純合型。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。
[0013] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，可為檢測(cè)大豆基因組中基于Map_6064SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或 基因型的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的功能為如下（a)、（b)或（c):
[0014] (a)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀；
[0015] (b)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性；
[0016] (c)篩選或輔助篩選具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒。
[0017] 上述產(chǎn)品中，所述大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基因型可為T(mén)T純合型或 CC純合型。
[0018] 上述產(chǎn)品中，所述Map-6064位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第5條染色體的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6064位點(diǎn)為序列表中序列1的第891位。
[0019] 上述產(chǎn)品中，所述檢測(cè)大豆基因組中基于Map_6064SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的 物質(zhì)可包括Map-6064SNP探針組。
[0020] 上述產(chǎn)品中，所述棕櫚酸含量為高棕櫚酸含量或低棕櫚酸含量；所述高棕櫚酸含 量指的是棕櫚酸含量可為12. 3%以上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3%。
[0021] 檢測(cè)大豆基因組中基于Map_6064SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在下述 (1)-(6)中的任一應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0022] (1)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀；
[0023] (2)制備鑒定或輔助鑒定大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀的產(chǎn)品；
[0024] (3)鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性；
[0025] (4)制備鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn) 品；
[0026] (5)篩選或輔助篩選具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒；
[0027] (6)制備篩選或輔助篩選具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒的產(chǎn)品。
[0028] 上述應(yīng)用中，所述⑴和/或所述⑵中，所述大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀可為高 棕櫚酸含量性狀或低棕櫚酸含量性狀。所述高棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量可為12. 3 %以 上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3%。
[0029] 上述應(yīng)用中，所述⑶和/或所述⑷中，所述大豆籽粒的棕櫚酸含量性狀可為高 棕櫚酸含量性狀或低棕櫚酸含量性狀。所述高棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量可為12. 3 %以 上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3%。
[0030] 上述應(yīng)用中，所述（5)和/或所述（6)中，所述具有不同棕櫚酸含量的大豆籽粒 可為具有高棕櫚酸含量性狀的大豆籽?；蚓哂械妥貦八岷啃誀畹拇蠖棺蚜！Ｋ龈咦?櫚酸含量指的是棕櫚酸含量可為12. 3%以上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于 12. 3%〇
[0031] 上述應(yīng)用中，所述大豆基因組中基于Map-6064SNP位點(diǎn)的基因型可為T(mén)T純合型或 CC純合型。
[0032] 上述應(yīng)用中，所述Map-6064位點(diǎn)的所在基因?yàn)榇蠖够蚪M第5條染色體的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列為序列表的序列1 ;所述 Map-6064位點(diǎn)為序列表中序列1的第891位。
[0033] 上述應(yīng)用中，所述用于檢測(cè)大豆基因組中基于Map_6064SNP位點(diǎn)的多態(tài)性或基因 型的物質(zhì)可包括Map-6064SNP探針組。
[0034]上述任一所述Map_6064SNP探針組可由探針1、探針2和探針3組成：
[0035] 所述探針1為單鏈DNA分子，探針1的序列如序列表中序列2中的核苷酸所示。
[0036] 所述探針2為單鏈DNA分子，探針2的序列如序列表中序列3中的核苷酸所示。
[0037] 所述探針3為單鏈DNA分子，探針3的序列如序列表中序列4中的核苷酸所示。
[0038] 本發(fā)明中，所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3% ;所述高棕櫚酸含量 指的是棕櫚酸含量可為12. 3%以上。
[0039] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的一種鑒定或輔助鑒定大豆籽粒棕櫚酸含量性狀的方法 可以用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)大豆品種中大豆籽粒棕櫚酸含量的高低。所述高棕櫚酸含量 指的是棕櫚酸含量為12. 3%以上；所述低棕櫚酸含量指的是棕櫚酸含量小于12. 3%。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0041] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實(shí)施例中所述40個(gè)南方大豆品種和60個(gè)北方大豆品種記載在如下文獻(xiàn)中： 王國(guó)勛.中國(guó)大豆品種資源目錄.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1982 ;常汝鎮(zhèn)，孫建英.中國(guó)大豆 品種資源目錄：續(xù)編一.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991;常汝鎮(zhèn)，孫建英，邱麗娟，陳一舞.中國(guó)大 豆品種資源目錄：續(xù)編二.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996。
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