弧菌檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種弧菌檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 弧菌是一類廣泛分布于海洋環(huán)境的嗜鹽性革蘭氏陰性桿菌，隸屬弧菌科，弧菌屬， 具有豐富的多樣性?，F(xiàn)在有10多種是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病原菌，包括河流弧菌、鰻弧菌、溶藻弧 菌等。河流弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌均為條件致病菌，當(dāng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物在不良的環(huán)境條件 下，遭遇不利刺激或是受傷時(shí)，會(huì)誘發(fā)疾病的產(chǎn)生。
[0003] 隨著人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水域生態(tài)變化，弧菌病已經(jīng)成為海水養(yǎng)殖動(dòng)物主要 的細(xì)菌性病害之一。具有流行廣、發(fā)病率高、危害大、死亡率高等特點(diǎn)，給魚、蝦、蟹及貝類等 海水動(dòng)物的養(yǎng)殖造成了巨大的影響。有研究表明：當(dāng)水中弧菌的數(shù)量為10 3-104cfu/mL時(shí)對(duì) 蝦的紅腿病癥狀明顯加重，cfu/mL即每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù)。河流弧菌、鰻孤菌 和溶藻弧菌能引起世界范圍內(nèi)的50多種淡海水養(yǎng)殖魚類及其它養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)生弧菌病。很 多研究表明，這三種弧菌是多種養(yǎng)殖對(duì)蝦感染發(fā)病的重要原因?？梢砸饘?duì)蝦紅腿、黃鰓、 斷須、額劍和尾部潰爛；對(duì)外界反應(yīng)遲鈍；部分蝦體發(fā)黑和肌肉白濁。河弧菌腸、溶藻弧菌 還能使人治病，引起散發(fā)性腹瀉。對(duì)弧菌引起的疾病的防治主要采取"預(yù)防為主、重點(diǎn)監(jiān)測(cè)、 防治結(jié)合"的綜合措施，有效地檢測(cè)弧菌的方法將為弧菌的預(yù)防提供基本保障。
[0004] PCR檢測(cè)法是檢測(cè)弧菌的有效方法之一，但由于目前PCR檢測(cè)的特異性不夠，對(duì)弧 菌的檢測(cè)容易受到不同致病菌或其他因素的干擾，容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，更加無法對(duì)多 種弧菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，且檢測(cè)靈敏度有限，當(dāng)弧菌含量較低時(shí)無法及時(shí)檢測(cè)出來，造成檢測(cè) 效率偏低、準(zhǔn)確性不夠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的弧菌檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明第一方面提供了檢測(cè)弧菌的引物組，包括以下一對(duì)或多對(duì)引物：
[0007] toxR基因引物對(duì)：
[0008] 上游引物 toxR-F 序列為：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，即序列表 SEQ ID No. 1 ;
[0009] 下游引物 toxR-R 序列為：GTCGTAAACAAAATGACACAA，即序列表 SEQ ID No. 2 ;
[0010] flaA基因引物對(duì)：
[0011] 上游引物 flaA-F 序列為：TTACGCAGAAGCGGTGAT，即序列表 SEQ ID No. 3 ;
[0012] 下游引物 flaA-R 序列為：GCTGITGGATGAAGGGTC，即序列表 SEQ ID No. 4 ;
[0013] pyrH基因引物對(duì)：
[0014] 上游引物 pyrH-F 序列為：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，即序列表 SEQ ID No. 5 ;
[0015] 下游引物 pyrH-R 序列為：CCATCAACITTCGTCGCTTT，即序列表 SEQ ID No. 6。
[0016] 本發(fā)明第二方面提供了一種檢測(cè)弧菌的方法，所述方法包括使用以下一對(duì)或多對(duì) 引物對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟：
[0017] toxR基因引物對(duì)：
[0018] 上游引物 toxR-F 序列為：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，即序列表 SEQ ID No. 1 ;
[0019] 下游引物 toxR-R 序列為：GTCGTAAACAAAATGACACAA，即序列表 SEQ ID No. 2 ;
[0020] flaA基因引物對(duì)：
[0021] 上游引物 flaA-F 序列為：TTACGCAGAAGCGGTGAT，即序列表 SEQ ID No. 3 ;
[0022] 下游引物 flaA-R 序列為：GCTGITGGATGAAGGGTC，即序列表 SEQ ID No. 4 ;
[0023] pyrH基因引物對(duì)：
[0024] 上游引物 pyrH-F 序列為：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，即序列表 SEQ ID No. 5 ;
[0025] 下游引物 pyrH-R 序列為：CCATCAACITTCGTCGCTTT，即序列表 SEQ ID No. 6。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明分別以河流弧菌toxR基因，鰻弧菌的flaA基因和 溶藻弧菌的pyrH基因設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法對(duì)水環(huán)境中弧菌進(jìn)行檢測(cè)，特異性強(qiáng)，并且 可以快速方便地確定致病菌的種類，實(shí)現(xiàn)對(duì)弧菌中的河流弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌的同時(shí) 檢測(cè)及單獨(dú)檢測(cè)，提高了鑒定效率。本發(fā)明是直接利用活菌作為模板構(gòu)建PCR體系，省去 了從細(xì)菌中提取DNA的步驟，操作更簡(jiǎn)單方便，成本更低。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確且靈敏度高，對(duì) 弧菌中的河流弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌可檢測(cè)出的最低濃度依次達(dá)到5.21 X102cfU/mL、 2. 70X 104cfu/mL、2. 48X 102cfu/mL，對(duì)防止海水養(yǎng)殖動(dòng)物主要細(xì)菌性病害之一的弧菌病具 有重要意義。
【附圖說明】
[0027] 圖1為toxR基因引物對(duì)、flaA基因引物對(duì)、pyrH基因引物對(duì)的特異性檢驗(yàn)結(jié)果 示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為河流弧菌模板與河流弧菌toxR引物對(duì)擴(kuò) 增結(jié)果；2為鰻弧菌模板與河流弧菌toxR引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；3為溶藻弧菌模板與河流弧菌 toxR引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；4為副溶血弧菌模板與河流弧菌toxR引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；5為鰻弧菌 模板與鰻弧菌flaA引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；6為河流弧菌模板與鰻弧菌flaA-F引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果； 7為溶藻弧菌模板與鰻弧菌flaA引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；8為副溶血弧菌模板與鰻弧菌flaA引物 對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；9為溶藻弧菌模板與溶藻弧菌pyrH引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；10為河流弧菌模板與溶 藻弧菌pyrH引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；11為鰻弧菌模板與溶藻弧菌pyrH引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；12為副 溶血弧菌活菌稀釋液與溶藻弧菌pyrH引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果。
[0028] 圖2為對(duì)河流弧菌的靈敏度檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1的河流弧菌濃度為5. 21 X 106cfu/mL ;2的河流弧菌濃度為5. 21 X 105cfu/mL ;3的河流弧 菌濃度為5. 21 X 104cfu/mL ;4的河流弧菌濃度為5. 21 X 103cfu/mL ;5的河流弧菌濃度為 5. 21 X 102cfu/mL ;6的河流弧菌濃度為5. 21 X lC^cfu/mL ;7的河流弧菌濃度為5. 21cfu/ mL ;8為空白對(duì)照組，即不含河流弧菌。
[0029] 圖3為對(duì)鰻弧菌的靈敏度檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 的鰻弧菌濃度為2. 70X 107cfu/mL ;2的鰻弧菌濃度為2. 70X 106cfu/mL ;3的鰻弧菌濃度為 2. 70X 105cfu/mL ;4 的鰻弧菌濃度為 2. 70X 104cfu/mL ;5 的鰻弧菌濃度為 2. 70X 103cfu/ mL ;6的鰻弧菌濃度為2. 70X 102cfU/mL ;7為空白對(duì)照組，即不含鰻弧菌。
[0030] 圖4為對(duì)溶藻弧菌的靈敏度檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)；1的溶藻弧菌濃度為2.48X107cfu/mL;2的溶藻弧菌濃度為2.48X 106cfu/mL;3的 溶藻弧菌濃度為2. 48X 105cfU/mL ;4的溶藻弧菌濃度為2. 48X 104cfU/mL ;5的溶藻弧菌 濃度為2.48X 103cfu/mL ;6的溶藻弧菌濃度為2.48X 102cfu/mL ;7的溶藻弧菌濃度為 2. 48X lOkfu/mL ;8為空白對(duì)照組，即不含溶藻弧菌。
[0031] 圖5為同時(shí)對(duì)河流弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌中的任意兩種弧菌或三種弧菌進(jìn)行檢 測(cè)的結(jié)果示意圖；其中，M為2000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為flaA基因引物對(duì)、toxR基因引物 對(duì)和pyrH基因引物對(duì)對(duì)PCR模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增的結(jié)果；2為f laA基因引物對(duì)和toxR 基因引物對(duì)對(duì)PCR模板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增的結(jié)果；3為toxR基因引物對(duì)和pyrH基因引物對(duì) 對(duì)PCR模板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增的結(jié)果；4為f laA基因引物對(duì)和pyrH基因引物對(duì)對(duì)PCR模 板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增的結(jié)果；5為空白對(duì)照，即不采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 本發(fā)明第一方面提供了檢測(cè)弧菌的引物組，包括以下一對(duì)或多對(duì)引物：
[0033] toxR基因引物對(duì)：
[0034] 上游引物 toxR-F 序列為：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，如序列表 SEQ ID No. 1 所示；
[0035] 下游引物 toxR-R 序列為：GTCGTAAACAAAATGACACAA，如序列表 SEQ ID No. 2 所示；
[0036] flaA基因引物對(duì)：
[0037] 上游引物 flaA-F 序列為：TTACGCAGAAGCGGTGAT，如序列表 SEQ ID No. 3 所示；
[0038] 下游引物 flaA-R 序列為：GCTGITGGATGAAGGGTC，如序列表 SEQ ID No. 4 所示；
[0039] pyrH基因引物對(duì)：
[0040] 上游引物pyrH-F序列為：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，如序列表 SEQ ID No. 5 所示；
[0041] 下游引物 pyrH-R 序列為：CCATCAACITTCGTCGCTTT，如序列表 SEQ ID No. 6 所示。
[0042] 本發(fā)明第二方面提供了一種檢測(cè)弧菌的方法，其特征在于：所述方法包括使用以 下一對(duì)或多對(duì)引物對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟：
[0043] toxR基因引物對(duì)：
[0044] 上游引物 toxR-F 序列為：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，如序列表 SEQ ID No. 1 所示；
[0045] 下游引物 toxR-R 序列為：GTCGTAAACAAAATGACACAA，如序列表 SEQ ID No. 2 所示；
[0046] flaA基因引物對(duì)：
[0047] 上游引物 flaA-F 序列為：TTACGCAGAAGCGGTGAT，如序列表 SEQ ID No. 3 所示；
[0048] 下游引物 flaA-R 序列為：GCTGITGGATGAAGGGTC，如序列表