電穿孔方法與設(shè)備的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要是與細胞電刺激相關(guān)的方法與設(shè)備，特別是細胞電穿孔的方法與設(shè)備。
【背景技術(shù)】
[0002]電穿孔是廣泛使用的以電刺激來暫時性產(chǎn)生細胞膜穿孔的讓細胞膜具有通透性的方法。電穿孔的應(yīng)用包括把DNA (脫氧核糖核酸)、RNA (核糖核酸)、siRNA (小干涉RNA)、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、藥物或者其他物質(zhì)傳送到多種細胞，比如哺乳動物細胞、植物細胞、酵母、其他真核細胞、細菌、其他微生物和人類細胞。電刺激也可以用于細胞融合來獲得雜種瘤細胞或者其他融合細胞。細胞電融合可以看做是一種特殊的細胞電穿孔。
[0003]—般在電穿孔過程中，細胞懸浮在一種有利于細胞存活的緩沖液或者介質(zhì)中。細菌的電穿孔一般使用低電導(dǎo)率的液體，比如水，來降低瞬間大電流產(chǎn)生的熱量。細胞懸浮液接著加進一個具有兩個平電極的矩形電極杯中來放電。例如位于加州赫苦斯的伯樂(B1-Rad)公司生產(chǎn)了 Gene Pulser系列產(chǎn)品來進行電極杯中的細胞電穿孔。傳統(tǒng)上細胞電穿孔需要很高的電場強度。
[0004]電穿孔過程通常對細胞具有毒性。首先，當電場強度太高的時候細胞膜可能會被不可逆地破壞。其次，當電場作用產(chǎn)生的細胞膜穿孔可以允許目標物質(zhì)進入細胞的時候，這些穿孔可能也會允許細胞內(nèi)部物質(zhì)外流或者外部其他物質(zhì)的不受控內(nèi)流導(dǎo)致對細胞活性的負面影響。第三，電流產(chǎn)生的熱量可能破壞細胞。最后，電極附近電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的毒性物質(zhì)比如自由基、氣體和金屬離子可能會破壞細胞。
[0005]細胞性狀的不同，也就是細胞差異性是成功取得高效率、低細胞毒性的電穿孔結(jié)果的最大障礙。細胞大小是一個已知的細胞差異性因素。大細胞的電穿孔相對比較容易。在一個具有不同大小細胞的混合液中，當較大細胞在某個電壓下得到有效電穿孔時，這個電壓往往不足以將較小細胞有效電穿孔。在提高電場強度使較小細胞有效電穿孔時，較大細胞通常被過高電壓不可逆地損傷以致不能存活。其他因素比如細胞膜成分的區(qū)別或者細胞成熟狀態(tài)的區(qū)別也可能增加細胞差異性。
[0006]雖然以前有改善電穿孔效率的多種努力，細胞差異性這個關(guān)鍵問題一直沒有得到解決。電穿孔的效率、細胞存活率與經(jīng)濟性有待提高。本文所公開的設(shè)備和方法旨在解決一個或者多個前述的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明公開了一種生物細胞電穿孔的裝置。所述裝置包括一個含有絕緣室體的樣品容器。所述樣品容器含有用來提供電連接的第一電極與第二電極。所述絕緣室體用于容納至少一個細胞單層。所述裝置還含有可以產(chǎn)生細胞電穿孔所需脈沖的脈沖發(fā)生器。
[0008]本發(fā)明公開了另一種生物細胞電穿孔的裝置。所述裝置包含一個盛放生物細胞樣品來進行電穿孔的樣品容器。所述樣品容器包含一個形成容器主體來盛放細胞的絕緣室體。所述絕緣室體含有多個側(cè)面。所述樣品容器還包括第一電極與第二電極來接受電脈沖發(fā)生器產(chǎn)生的電脈沖進行細胞電穿孔。所述絕緣室體和電極可以把生物細胞樣品密封在樣品容器里面。
[0009]本發(fā)明還公開了一種生物細胞電穿孔的方法。所述細胞在樣品容器的絕緣室體里面排列形成至少一個細胞單層。所述樣品容器含有第一電極與第二電極來提供電穿孔時的電連接。所述細胞單層里面的細胞利用脈沖發(fā)生器產(chǎn)生的所需電脈沖來進行電穿孔。
[0010]本發(fā)明公開的其他實施方式可以通過說明書、權(quán)利要求書與附圖使本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解。
【附圖說明】
[0011]圖1A示出了與所披露實施例相一致的細胞電穿孔示例性設(shè)備；
[0012]圖1B示出了與所披露實施例相一致的在樣品容器中形成的示例性細胞單層；
[0013]圖1C示出了與所披露實施例相一致的在樣品容器中形成的示例性細胞單層；
[0014]圖2A示出了球形絕緣細胞的阻擋和分流作用對電流的影響；
[0015]圖2B示出了細胞電穿孔的有效表面；
[0016]圖3示出了細胞體積大小對于細胞電穿孔的有效表面的影響；
[0017]圖4示出了在所指示電流方向下的三種代表性細胞相鄰位置；
[0018]圖5示出了流過細胞單層的電流的分布；
[0019]圖6示出了使用類似細胞的人造絕緣顆粒增加細胞總數(shù)量；
[0020]圖7示出了與所披露實施例相一致的樣品容器；
[0021]圖8示出了與所披露實施例相一致的樣品容器；
[0022]圖9A不出了與所披露實施例相一致的樣品容器；
[0023]圖9B不出了與所披露實施例相一致的樣品容器；
[0024]圖10示出了與所披露實施例相一致的利用離心技術(shù)制造出一個緊密的細胞單層或多個細胞單層用于電穿孔或者細胞電融合；
[0025]圖1lA示出了與所披露實施例相一致的樣品容器；
[0026]圖1lB不出了與所披露實施例相一致的樣品容器；
[0027]圖12A示出了與所披露實施例相一致的樣品容器；
[0028]圖12B示出了與所披露實施例相一致的樣品容器；
[0029]圖13示出了與所披露實施例相一致的電穿孔示例性流程；
[0030]圖14A示出了與所披露實施例相一致的示例性設(shè)備；
[0031]圖14B示出了與所披露實施例相一致的下層介質(zhì)在電穿孔中的應(yīng)用；
[0032]圖15示出了示例的毛細管輔助進行的電穿孔。
【具體實施方式】
[0033]現(xiàn)參照附圖將本發(fā)明的示例性實施例給出詳細的說明。各圖中將盡可能使用相同附圖標記來表示相同或相似的組成部分。
[0034]圖1A示出了與所披露實施例相一致的示例性電穿孔裝置100。所述裝置100包括一個樣品容器10。樣品容器10包括絕緣室體14、第一電極15a和第二電極15b。樣品容器10內(nèi)，在下層介質(zhì)12的表面上和上層介質(zhì)13的下面形成一個界面。一個跨越電流場的細胞單層11可以形成在所述界面上。在本發(fā)明中使用的細胞單層是指單個、緊密填充的細胞層。因此一個細胞單層有時也稱為一個緊密細胞單層或者一個緊密單層。裝置100還包括一個脈沖發(fā)生器18。樣品容器10可以放入脈沖發(fā)生器18中，電脈沖從第一電極15a和第二電極15b釋放。圖1B示出了細胞單層11在絕緣室體14內(nèi)的截面圖。如圖1B所示，細胞單層11占據(jù)了絕緣室體14的橫截面。
[0035]裝置100可以用細胞電穿孔模型分析中的一些概念來實現(xiàn)。圖2A示出了半徑為R的球形細胞在原本均一的電流或者電場中。對于一個典型的用來傳送DNA、RNA、蛋白質(zhì)到細胞的電穿孔，電擊在介質(zhì)或者在鹽水緩沖液中進行。與細胞外溶液和細胞內(nèi)部細胞漿相比，以磷脂雙分子層為基礎(chǔ)的細胞膜有非常低的電導(dǎo)性，因此大部分電流繞過細胞內(nèi)部。因此細胞類似于一個絕緣體。
[0036]細胞膜的絕緣功能可以保護細胞內(nèi)部以免在電穿孔時暴露在短時間強電場下。如圖2A所示，球形絕緣體細胞對電流的阻擋和分流能使原本均一的電場變成繞細胞鼓脹的電場。
[0037]細胞膜上某個位置的點可以通過其半徑與總電流方向之間的夾角Θ來指定。導(dǎo)電介質(zhì)中帶負電荷的分子例如DNA、RNA和蛋白質(zhì)運動方向與電流方向相反。
[0038]對于一個置于原本均一電流場的半徑為R的細胞，在細胞膜上半徑夾角為Θ的指定位置上的跨膜電勢能夠大致通過以下方程建模計算:
[0039]V0 = 1.5*E0*R.cos θ(I)
[0040]方程中Ε。代表原本均一電場中的電場強度。在總電流方向指定的兩個頂點上Θ為O?；蛘?80° , cos Θ等于I或者-1，跨膜電勢值最高。在電流方向下游的頂點(Θ =0° )而不是電流方向上游位置的頂點(Θ = 180° )，帶負電荷的分子例如DNA、RNA和蛋白質(zhì)在最大電勢下穿過細胞膜。相反，在Θ等于90°的細胞膜上該點的跨膜電勢為0，盡管在細胞膜這些點外的電流最強。
[0041]當Θ為0°跨膜電勢最大，當Θ為90°時跨膜電勢減少至O。細胞膜某點上跨膜電勢越大可以產(chǎn)生更大的分子傳輸動力。為了傳送某個物質(zhì)，需要一個最小的跨膜電勢Vnin0 Θ在0°到90°范圍內(nèi)有一個最大值θ_，此處跨膜電勢為V_。同時，細胞上Θ值更小的點上的跨膜電勢不能超過可能對細胞造成不可逆損害的跨膜電勢值。Θ _確定了最大有效電轉(zhuǎn)表面。
[0042]圖2B示出了在球形細胞上的有效電轉(zhuǎn)表面(以陰影表示)。本發(fā)明中的有效電轉(zhuǎn)表面或者細胞電轉(zhuǎn)的有效面是指具有足夠的跨膜電勢可以允許外源性物質(zhì)例如DNA、RNA或者蛋白質(zhì)進入細胞內(nèi)部的部分細胞表面。利用細胞電穿孔將大分子例如DNA、RNA或者蛋白質(zhì)引進細胞內(nèi)，細胞只有在特定跨膜電勢下才能存活。在圖2B中，Vniax代表了最大可承受跨膜電勢值，大于該值時細胞會受到不可逆的損害。￥_代表了可以進行有效電穿孔的最小可滲透跨膜電勢值，小于該值外源物質(zhì)將無法進入細胞內(nèi)。VniaJP V _的值是由細胞膜的特性決定的。不管傳送目標物質(zhì)的種類，Vj直都一樣，而V _與傳送目標物質(zhì)的分子特性例如大小與帶電量有關(guān)。傳送較大的分子時的￥_可能較大。VniaJPVnun之間的窗口是電穿孔中跨膜電勢的有效范圍，此范圍可能比較小，尤其是在傳送較大分子時。
[0043]如圖2B所示，只有在細胞頂點位置可以達到跨膜電勢最高值V_。陰影所示的有效電轉(zhuǎn)表面的外邊界的跨膜電勢值Sv_，其半徑夾角為θ_。對于帶負電荷的分子例如DNA、RNA和蛋白質(zhì)，他們的有效電轉(zhuǎn)表面位于電流方向下游。
[0044]在頂點上，Θ = O。因而cos θ=1,
[0045]推導(dǎo)出Vnax= 1.5.E。.R
[0046]在θ_處，跨膜電勢減少至V_:
[0047]Vnin= 1.5.E 0.R.cos Θ 隨=V _.cos Θ _
[0048]因此Θ _的值可以通過以下公式確定:
[0049]cos Θ nax= Vnin/Vnax
[0050]通過這個模型分析，細胞頂點的分子傳輸速度最高。某點傳輸速度隨著Θ值的增加而減小，到Θ _處減少至O。
[0051]當把不同半徑的細胞放置于均一電場中，每個細胞有各自不同的跨膜電勢分布圖。VnuJPVniax的絕對值受一些特定因素的變化的影響。例如，使用不同的電脈沖波形例如指數(shù)衰減波或者方波，v_和V _的值可能會不同。盡管如此，V _/v_的比值可能對這些類型的變化比較不敏感。
[0052]圖3示出了細胞大小對細胞電穿孔的有效表面的影響。細胞膜本質(zhì)上是分布著膜蛋白且包括一些通道的磷脂雙分子層。同種類型的細胞具有類似的細胞膜組成，盡管細胞大小在某種程度上不同。因此，對于同一