一種從紅豆杉葉中提取紫杉醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種從紅豆杉葉中提取紫杉醇的方法，屬于植物提取物的分離純化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]紅豆杉是一種珍貴的藥用植物，為世界珍稀瀕危樹(shù)種，國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物，被譽(yù)為“植物黃金”。南方紅豆杉枝葉的次生代謝代謝產(chǎn)物中，其藥用價(jià)值中除含有極少量的紫杉醇成分已在臨床上廣泛用于治療各種惡性腫瘤，被認(rèn)為是最好的抗癌藥之一。
[0003]由于紅豆杉枝葉中含有大量的色素、蠟質(zhì)油脂及相似物質(zhì)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)使得紫杉醇的分離提取操作更為復(fù)雜，傳統(tǒng)從紅豆杉樹(shù)皮中提取紫杉醇的方法根本無(wú)法適用。為此，本領(lǐng)域的各大企業(yè)不惜花費(fèi)巨額資金組織科研人員進(jìn)行了大量、反復(fù)的研究，各種研究成果在公開(kāi)出版物上屢見(jiàn)報(bào)道。
[0004]這些技術(shù)雖能從紅豆杉的枝葉中有效分離提取紫杉醇，但其純化效果非常不理想，無(wú)法直接達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)(中國(guó)藥典2010年版)，需要進(jìn)行后續(xù)的純化操作，從而增加紫杉醇的提取成本，提取效率低，不能適宜規(guī)模批量化生產(chǎn)，且在提取過(guò)程中，使用大量有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題:針對(duì)目前紅豆杉枝葉提取過(guò)程中，含有大量的色素、蠟質(zhì)油脂及相似物質(zhì)等雜質(zhì)，在分離提取過(guò)程中操作復(fù)雜，使用大量的有機(jī)溶劑，造成環(huán)境污染，且提取效率低，提取純度未達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明提供了一種從紅豆杉葉中提取紫杉醇的方法，本發(fā)明首先收集紅豆杉主根周?chē)寥?，通過(guò)使用水解絡(luò)蛋白等物質(zhì)對(duì)土壤內(nèi)的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，再使用紅豆杉落葉做營(yíng)養(yǎng)物，對(duì)土壤內(nèi)的微生物進(jìn)行篩選，最后與新鮮紅豆杉葉進(jìn)行發(fā)酵，再進(jìn)行甲醇稀釋?zhuān)峒兊炔襟E得到純度在99.6%的紫杉醇。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)取紅豆杉主根周?chē)鶬?3cm處的土壤放入容器中，按重量份數(shù)計(jì)，取45?65份的蛋白瓊脂、5?10份的水解絡(luò)蛋白、4?8份的氯化鉀、10?15份的腐殖質(zhì)及18?20份去離子水，攪拌均勻并加入容器中，加入量為土壤質(zhì)量的10?25%，攪拌均勻，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化氫溶液調(diào)節(jié)其pH為6.0?6.5 ;
(2)待上述調(diào)節(jié)pH完成后，密封容器，攪拌7?10天，保持溫度為28?35°C，含水量為16%，轉(zhuǎn)速設(shè)定為120?150r/min，在此過(guò)程中每4?6h向容器內(nèi)通氧氣，氧氣通入量為容器體積的30?40%，攪拌結(jié)束后，向容器內(nèi)每10?15h加入紅豆杉落葉，加入量為土壤質(zhì)量的20?25%，混合均勻，如此培養(yǎng)15?20天；
(3)上述培養(yǎng)結(jié)束后，將容器內(nèi)的土壤移至發(fā)酵池內(nèi)，按與土壤質(zhì)量比1:3，加入新鮮紅豆杉葉，攪拌均勻，密封發(fā)酵12?14天，保持溫度為28?35°C，發(fā)酵池內(nèi)部含水量為15?20%，發(fā)酵池內(nèi)部空氣中氧氣含量為5?8% ； (4)待上述發(fā)酵結(jié)束后，向其中加入甲醇，淹沒(méi)發(fā)酵物3?6cm，在轉(zhuǎn)速1000?1200r/min下，攪拌40?45min，然后靜置I?2h，收集液體，將所得的液體放入離心機(jī)中離心分離，收集上清液；
(5)將上述所得的上清液通過(guò)硅膠柱分離，流動(dòng)相為正己烷，洗脫速度為I?3個(gè)柱體積/小時(shí)，洗脫液用量為8?10個(gè)柱體積，將柱層析收集的餾分，濃縮蒸干，然后向其中加入去離子水，加入量為甲醇體積的80?110%，放置24?26h后過(guò)濾，將過(guò)濾物再減壓烘干，即可。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明使用生物法對(duì)紅豆杉葉進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)環(huán)境無(wú)污染；
(2)本發(fā)明所制得的紫杉醇純度達(dá)到99.6%以上；
(3)本發(fā)明制作成本與傳統(tǒng)方法相比，降低了10?20%，易于操作。
【具體實(shí)施方式】
[0008]取紅豆杉主根周?chē)鶬?3cm處的土壤放入容器中，按重量份數(shù)計(jì)，取45?65份的蛋白瓊脂、5?10份的水解絡(luò)蛋白、4?8份的氯化鉀、10?15份的腐殖質(zhì)及18?20份去離子水，攪拌均勻并加入容器中，加入量為土壤質(zhì)量的10?25%，攪拌均勻，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化氫溶液調(diào)節(jié)其pH為6.0?6.5 ;待上述調(diào)節(jié)pH完成后，密封容器，攪拌7?10天，保持溫度為28?35°C，含水量為16%，轉(zhuǎn)速設(shè)定為120?150r/min，在此過(guò)程中每4?6h向容器內(nèi)通氧氣，氧氣通入量為容器體積的30?40%，攪拌結(jié)束后，向容器內(nèi)每10?15h加入紅豆杉落葉，加入量為土壤質(zhì)量的20?25%，混合均勻，如此培養(yǎng)15?20天；上述培養(yǎng)結(jié)束后，將容器內(nèi)的土壤移至發(fā)酵池內(nèi)，按與土壤質(zhì)量比1:3，加入新鮮紅豆杉葉，攪拌均勻，密封發(fā)酵12?14天，保持溫度為28?35°C，發(fā)酵池內(nèi)部含水量為15?20%，發(fā)酵池內(nèi)部空氣中氧氣含量為5?8% ;待上述發(fā)酵結(jié)束后，向其中加入甲醇，淹沒(méi)發(fā)酵物3?6cm，在轉(zhuǎn)速1000?1200r/min下，攪拌40?45min，然后靜置I?2h，收集液體，將所得的液體放入離心機(jī)中離心分離，收集上清液；將上述所得的上清液通過(guò)硅膠柱分離，流動(dòng)相正己烷，洗脫速度為I?3個(gè)柱體積/小時(shí)，洗脫液用量為8?10個(gè)柱體積，將柱層析收集的餾分，濃縮蒸干，然后向其中加入去離子水，加入量為甲醇體積的80?110%，放置24?26h后過(guò)濾，將過(guò)濾物再減壓烘干，即可。
[0009]實(shí)例I
取紅豆杉主根周?chē)鶬cm處的土壤放入容器中，按重量份數(shù)計(jì)，取47份的蛋白瓊脂、10份的水解絡(luò)蛋白、8份的氯化鉀、15份的腐殖質(zhì)及20份去離子水，攪拌均勻并加入容器中，加入量為土壤質(zhì)量的10%，攪拌均勻，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化氫溶液調(diào)節(jié)其pH為6.0 ;待上述調(diào)節(jié)pH完成后，密封容器，攪拌7天，保持溫度為28°C，含水量為16%，轉(zhuǎn)速設(shè)定為120r/min，在此過(guò)程中每4h向容器內(nèi)通氧氣，氧氣通入量為容器體積的30%，攪拌結(jié)束后，向容器內(nèi)每1h加入紅豆杉落葉，加入量為土壤質(zhì)量的20%，混合均勻，如此培養(yǎng)15天；上述培養(yǎng)結(jié)束后，將容器內(nèi)的土壤移至發(fā)酵池內(nèi)，按與土壤質(zhì)量比1: 3，加入新鮮紅豆杉葉，攪拌均勻，密封發(fā)酵12天，保持溫度為28°C，發(fā)酵池內(nèi)部含水量為15 %，發(fā)酵池內(nèi)部空氣中氧氣含量為5 %;待上述發(fā)酵結(jié)束后，向其中加入甲醇，淹沒(méi)發(fā)酵物3cm，在轉(zhuǎn)速lOOOr/min下，攪拌40min，然后靜置