抗菌肽hp10及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于含5-20個(gè)氨基酸的肽合成技術(shù)領(lǐng)域以及化合物和藥物制劑的特定治 療活性技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗菌肽HP10及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 飼用抗生素在全球畜牧業(yè)的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。近年來(lái)，為了追 求更大的經(jīng)濟(jì)效益，動(dòng)物生產(chǎn)中抗生素的濫用現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，這不僅造成了動(dòng)物性食品中 的獸藥殘留問(wèn)題，還導(dǎo)致了耐藥菌株的產(chǎn)生，給畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的困擾。因 此，歐盟和韓國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)全面禁止畜禽飼料中使用抗生素，尋找抗生素替代品便成 為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中的一大熱點(diǎn)，特別是仔豬營(yíng)養(yǎng)，因?yàn)樽胸i免疫系統(tǒng)發(fā)育并不完善，很容易 感染有害細(xì)菌而影響其生產(chǎn)性能，嚴(yán)重者甚至死亡。
[0003] 抗菌肽是由生物體基因編碼且在核糖體內(nèi)合成的小肽類(lèi)物質(zhì)，是動(dòng)物非特異性免 疫的一個(gè)重要組成部分，其具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌以及殺滅寄生蟲(chóng)等多種生物學(xué)功 能，特別是對(duì)多重耐藥菌具有強(qiáng)大的殺傷作用?？咕膶?duì)機(jī)體無(wú)毒副作用、無(wú)殘留且不易產(chǎn) 生耐藥性，因此，開(kāi)發(fā)抗菌肽制劑替代飼用抗生素已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外動(dòng)物生產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱 點(diǎn)。然而，天然來(lái)源的抗菌肽大多存在分子量大而具有免疫原性、抗菌活性不高、對(duì)動(dòng)物細(xì) 胞具有毒副作用或會(huì)導(dǎo)致溶血等缺陷，在一定程度上限制了抗菌肽在生豬養(yǎng)殖中的推廣應(yīng) 用。通過(guò)分子設(shè)計(jì)和改造獲得分子量小、抗菌活性高和對(duì)動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒副作用的抗菌肽是 促進(jìn)抗菌肽在生豬養(yǎng)殖中應(yīng)用的有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于公開(kāi)了一種抗菌肽HP10。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于公開(kāi)了抗菌肽HP10的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于公開(kāi)了抗菌肽HP10的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 抗菌肽HP10,其中，所述抗菌肽HP10的氨基酸序列為HHHLHHIHKP。
[0009] 上述技術(shù)方案所述的抗菌肽HP10,其中，所述抗菌肽HP10的分子量為1292. 4Da， 等電點(diǎn)為8. 79。
[0010] 上述技術(shù)方案所述的抗菌肽HP10在斷奶仔豬料中的應(yīng)用。
[0011] 抗菌肽HP10的制備方法，包括下述步驟：
[0012] (1)、通過(guò)FM0C保護(hù)合成法將氨基酸序列為HHHLHHIHKP的抗菌肽HP10從C端到 N端逐一進(jìn)行激活和交聯(lián)；
[0013](2)、步驟（1)的產(chǎn)物經(jīng)HPLC反相柱層析脫鹽純化得到抗菌肽HP10。
[0014] 上述技術(shù)方案所述的制備方法制備所得的抗菌肽HP10在斷奶仔豬料中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0016] (1)、本發(fā)明中的抗菌肽HP10具有分子量小、人工合成方便、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、殺菌作 用強(qiáng)、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)；
[0017] (2)、本發(fā)明中的抗菌肽HP10在仔豬飼料中應(yīng)用具有能夠顯著改善仔豬腸道健 康、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高仔豬生長(zhǎng)性能的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】：
[0018] 1、圖1為抗菌肽HP10對(duì)24日齡斷奶仔豬腹瀉率的影響。
【具體實(shí)施方式】：
[0019] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)抗菌肽HP10及其制備 方法和應(yīng)用作進(jìn)一步的說(shuō)明，以下過(guò)程中均采用常規(guī)技術(shù)方法和儀器說(shuō)明書(shū)內(nèi)容進(jìn)行操 作。
[0020] 實(shí)施例1 :抗菌妝HP 10的制備：
[0021]抗菌肽HP10是在天然抗菌肽PMAP36 (GRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPIVGSIPLGCG) 的基礎(chǔ)上截取改造的，由于組氨酸是幼年動(dòng)物一種必不可少的氨基酸，且它的抗菌活性比 精氨酸和賴(lài)氨酸強(qiáng)，所以用組氨酸替代精氨酸和賴(lài)氨酸。
[0022] 抗菌肽HP10的化學(xué)合成方法，包括下述步驟：
[0023](1)、按照抗菌肽HP10的氨基酸序列HHHLHHIHKP，通過(guò)FM0C保護(hù)合成法將抗菌肽 HP10從C端到N端逐一進(jìn)行激活和交聯(lián)，由上海吉爾（GL)生化有限公司用固相化學(xué)合成法 通過(guò)全自動(dòng)多肽合成儀（ABI433)合成抗菌肽全序列；
[0024](2)、由上海吉爾（GL)生化有限公司對(duì)步驟⑴的產(chǎn)物用高效液相色譜（HPLC)反 相柱層析脫鹽純化；
[0025] 再利用電噴霧質(zhì)譜法（采用美國(guó)Agilent公司的Agilent6520Q-T0F四級(jí)桿飛行 時(shí)間質(zhì)譜儀）對(duì)抗菌肽加以鑒定，純度大于95%;
[0026] 2、純化的抗菌肽HP10分子量采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-T0F)測(cè)定，等電點(diǎn)使用等電聚焦電泳測(cè)定，氨基酸序列采用自動(dòng)氨基酸序列測(cè)定儀 進(jìn)行解析。
[0027] 抗菌肽HP10含10個(gè)氨基酸殘基，分子量為1292. 4Da，等電點(diǎn)為8. 79,其氨基酸序 列為 HHHLHHIHKP。
[0028] 以下通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明抗菌肽HP10在斷奶仔豬飼料中應(yīng)用中所具有 的有益效果。
[0029] 實(shí)驗(yàn)例1 :抗菌妝HP10抑菌實(shí)驗(yàn)：
[0030](1)、試驗(yàn)菌株：大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿 菌和巨大芽孢桿菌。
[0031] (2)、多肽母液（0.2%BSA+0.01%乙酸）：稱(chēng)取0.2g牛血清白蛋白（BSA)加入 80mLddH20水中混勻，再加入10 y L的乙酸溶液，然后用ddH20水定容至100mL，用0.22ym 孔徑的濾膜過(guò)濾除菌后，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032]通過(guò)測(cè)定抗菌肽 HP10 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC) 來(lái)反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度。將試驗(yàn)菌于37°C 過(guò)夜培養(yǎng)16h，再吸取100 y L過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮MHB肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2. 5~ 3h，直至菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后用lOmM磷酸鈉緩沖液（pH 7.4)懸浮菌體細(xì)胞，并稀釋 菌體，使其菌落數(shù)為106CFU/mL左右。96孔板的每排的第1號(hào)孔內(nèi)加入90 y L 10mM磷酸鈉 緩沖液（pH 7. 4)其它孔中加入50 y L緩沖液，第1號(hào)孔內(nèi)再加入10 y L待測(cè)多肽母液，然后 將第1號(hào)孔中的多肽溶液吸出50 y L加入第2號(hào)孔內(nèi)，依次類(lèi)推，倍比稀釋至第10號(hào)孔后， 吸出50 y L棄去；用加樣器吸取上述調(diào)整好的50 y L菌體依次加到96孔板的前11個(gè)孔中， 使最終接種細(xì)菌濃度為每孔5 X 105CFU/mL。將96孔板置微型振蕩器上振蕩混勻，微孔板加 蓋以減少孵育過(guò)程中的液體蒸發(fā)，于37°C下孵育2h。其中第11孔設(shè)定為陽(yáng)性對(duì)照組：即只 加50 y L緩沖液和50 y L菌液；第12孔為陰性對(duì)照組：即只加100 y L緩沖液。此時(shí)從第1 孔到第10孔抗菌肽的濃度將依次遞減；從每個(gè)孔中吸取50 iiL，連續(xù)稀釋至10-1、10-2、和 10-3,分別取20 y L點(diǎn)樣到MHA平板上的相應(yīng)區(qū)域。平板在37°C下孵育8~10h后取出計(jì) 數(shù)。
[0033] 結(jié)果判斷：陰性對(duì)照組在孵育結(jié)束后應(yīng)未長(zhǎng)菌，陽(yáng)性對(duì)照菌生長(zhǎng)良好。在一系列肽 濃度菌體計(jì)數(shù)中，未長(zhǎng)菌的最小濃度肽的處理組為L(zhǎng)C。試驗(yàn)重復(fù)操作三次。如表1所示。 從表中可以看出抗菌肽HP 10對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草 芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌均有非常強(qiáng)的殺傷作用。
[0034] 表1抗菌肽HP10的最小殺菌濃度（y M)
[0035]
[0036]實(shí)驗(yàn)例2 :抗菌肽HP10對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腸道健康和免疫功能的影響：
[0037] 選取21日齡運(yùn)輸后斷奶仔豬320頭，采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按體重和性別隨機(jī)分 到如表2所示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的4個(gè)處理組中，其中陰性對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧，HP10-50組為基 礎(chǔ)日糧中添加50mg/kg抗菌肽HP10 ;HP10-100組為基礎(chǔ)日糧中添加100mg/kg抗菌肽HP10， 陽(yáng)性對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧中添加l〇〇mg/kg金霉素，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭豬，試驗(yàn)期 14天。
[0038] 表2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
[0039]
[0040] 抗菌肽HP10對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腹瀉率和免疫球蛋白的影響見(jiàn)表3、圖1和表 4。從表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出抗菌肽HP10能夠顯著提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能；從圖1的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出抗菌肽HP10可改善斷奶仔豬腸道健康、降低斷奶仔豬腹瀉率；從表4的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出抗菌肽HP10可提高仔豬的免疫球蛋白濃度，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力和抗 病能力。
[0041] 表3抗菌肽HP10對(duì)24日齡斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響
[0042]
[0043] 表4抗菌肽HP10對(duì)24日齡斷奶仔豬免疫球蛋白的影響（g/L)
[0044]
[0045] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限 制，凡熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技 術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依 據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本 發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 抗菌肽HP10,其特征在于：所述抗菌肽HPlO的氨基酸序列為HHHLHHIHKP。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽HP10,其特征在于：所述抗菌肽HPlO的分子量為 1292. 4Da，等電點(diǎn)為 8. 79。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗菌肽HPlO在斷奶仔豬料中的應(yīng)用。4. 抗菌肽HPlO的制備方法，包括下述步驟： (1) 、通過(guò)FMOC保護(hù)合成法將氨基酸序列為HHHLHHIHKP的抗菌肽HPlO從C端到N端 逐一進(jìn)行激活和交聯(lián)； (2) 、步驟（1)的產(chǎn)物經(jīng)HPLC反相柱層析脫鹽純化得到抗菌肽HP10。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法制備所得的抗菌肽HPlO在斷奶仔豬料中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明抗菌肽HP10及其制備方法和應(yīng)用，屬于含5-20個(gè)氨基酸的肽合成技術(shù)領(lǐng)域以及化合物和藥物制劑的特定治療活性技術(shù)領(lǐng)域。所述抗菌肽HP10的氨基酸序列為HHHLHHIHKP；其分子量為1292.4Da，等電點(diǎn)為8.79。其制備包括下述步驟：(1)、通過(guò)FMOC保護(hù)合成法將氨基酸序列為HHHLHHIHKP的抗菌肽HP10從C端到N端逐一進(jìn)行激活和交聯(lián)；(2)、步驟(1)的產(chǎn)物經(jīng)HPLC反相柱層析脫鹽純化得到抗菌肽HP10。本發(fā)明中的抗菌肽HP10具有分子量小、人工合成方便、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、殺菌作用強(qiáng)、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)；還具有在仔豬飼料中應(yīng)用還具有能夠顯著改善仔豬腸道健康、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高仔豬生長(zhǎng)性能的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C07K7/06, A23K1/18, A23K1/16, C07K1/20, C07K1/10, C07K1/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105153281
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510600706
【發(fā)明人】姜文, 周盛昌, 蘇斌朝, 施建成, 肖麗萍, 葉俊標(biāo)
【申請(qǐng)人】廣州傲農(nóng)生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月18日