一種八肽sccscded及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種合成八肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物活性肽是對(duì)機(jī)體的功能或狀態(tài)具有積極作用并最終影響機(jī)體健康的特殊蛋 白質(zhì)片段。相較于蛋白質(zhì)而言，小分子肽片段的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在：更易被人體吸收利用； 活性高，在較小濃度下即可發(fā)揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過(guò) 人工化學(xué)合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在 吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無(wú)可比擬的優(yōu)越性。已有研究證實(shí)，人體小腸存在專(zhuān) 門(mén)的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸 收。許多研究表明，各種來(lái)源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種 作用，成為生物醫(yī)藥和保健品開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種具有體外抗腫瘤活性的合成多肽即合成八肽，可應(yīng)用于 生物制藥領(lǐng)域。
[0004] 本發(fā)明選取兩種腫瘤細(xì)胞MCF-7和H印G-2以及一種正常肝細(xì)胞L02為研究對(duì)象， 使用MTT法測(cè)定合成肽的體外抑制活性。
[0005] 本發(fā)明所述的合成多肽縮寫(xiě)為SCCS⑶ED，分子量861. 2,序列為： Ser-Cys-Cys-Ser-Cys-Asp-Glu-Asp 〇 其中， Ser表示英文名稱(chēng)為Serine，中文名稱(chēng)為絲氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Cys表示英文名稱(chēng)為Cysteine，中文名稱(chēng)為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Cys表示英文名稱(chēng)為Cysteine，中文名稱(chēng)為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Ser表示英文名稱(chēng)為Serine，中文名稱(chēng)為絲氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Cys表示英文名稱(chēng)為Cysteine，中文名稱(chēng)為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Asp表示英文名稱(chēng)為Aspartic acid，中文名稱(chēng)為天冬氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Glu表示英文名稱(chēng)為Glutamic acid，中文名稱(chēng)為谷氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Asp表示英文名稱(chēng)為Aspartic acid，中文名稱(chēng)為天冬氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。
[0006] 本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，通過(guò)樹(shù)脂的篩選，合理的多肽合 成方法。將目標(biāo)多肽的C-端羧基以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以這 個(gè)氨基酸的氨基作為起點(diǎn)，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過(guò)程，即 可以得到目標(biāo)多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護(hù)基，將肽鏈與樹(shù)脂分離，即得到目標(biāo)產(chǎn) 物。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程，固相合成順序從C端向N端合成。
[0007] 本發(fā)明將終濃度為100-500 Pg/mL的合成多肽與兩種腫瘤細(xì)胞MCF-7和H印G-2 混勻，孵育48 h后，經(jīng)MTT法檢測(cè)，對(duì)腫瘤細(xì)胞IfepG-2和MCF-7的體外增殖抑制率分別為 11. 85%-48. 49% 和 21. 14%-61. 86%。所述八肽 SCCSCDED 在濃度為 500Pg/mL，對(duì)腫瘤細(xì)胞 H印G-2和MCF-7的體外增殖抑制率分別為48. 49%和61. 86%。用100~500 Pg/mL的合成多 肽處理正常肝細(xì)胞L02后抑制率為4. 07%~23. 14%，所述八肽SCCS⑶ED在濃度為500l^g/mL 時(shí)，對(duì)正常肝細(xì)胞L02的體外增殖抑制率為23. 14%，表明對(duì)正常肝細(xì)胞L02有較小的殺傷作 用，可在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果： 本發(fā)明首次合成了該肽，并且采用MTT方法檢測(cè)了合成多肽的體外抗腫瘤活性，所述 合成多肽具有一定的腫瘤細(xì)胞抑制能力，同時(shí)，合成多肽對(duì)正常肝細(xì)胞有較小的殺傷作用。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖 1 為合成多肽Ser-Cys-Cys-Ser-Cys-Asp-Glu-Asp的HPLC圖。
[0010] 圖 2 為合成多肽Ser-Cys-Cys-Ser-Cys-Asp-Glu-Asp的ESI-MS圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于 此。對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0012] 多肽固相合成 選用高分子樹(shù)脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列 Ser-Cys-Cys-Ser-Cys-Asp-Glu-Asp的特征，先將Asp的羧基以共價(jià)鍵的形式與一個(gè)樹(shù)脂 相連，然后Asp的氨基和Glu的羧基縮水反應(yīng)，處理后，再添加Asp，Glu的氨基和Asp的 羧基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個(gè)Ser氨基酸后，再切除樹(shù)脂即得到目 標(biāo)多肽。采用高效液相色譜進(jìn)行純化，色譜柱型號(hào)為Phenomenex C1S，尺寸4. 6*150mm， 流動(dòng)相A:含有0. 1%三氟乙酸（TFA)的水；流動(dòng)相B:含有0. 09%TFA的溶液（80%乙 腈+20%水）；20 min內(nèi)B相由14. 0%上升到24. 0%，流速1. 0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。 液氮速凍，冷凍干燥，得到最后的產(chǎn)品，要求純度達(dá)到96. 2%以上，并經(jīng)ESI-MS鑒定結(jié) 構(gòu)。圖1為合成多肽Ser-Cys-Cys-Ser-Cys-Asp-Glu-Asp的HPLC圖。圖2為合成多肽 Ser-Cys-Cys-Ser-Cys-Asp-Glu-Asp 的 ESI-MS 圖 合成多肽的體外抑制活性 通過(guò)MTT比色法分析各多肽組分對(duì)肝癌細(xì)胞IfepG-2、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和正常肝細(xì) 胞L02的生長(zhǎng)抑制作用。具體操作步驟如下： 1) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)0. 25%(體積)的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相應(yīng)的 完全培養(yǎng)基終止消化并重懸細(xì)胞，血球平板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度至5 X 104個(gè)/mL， 加至96孔板中，每孔100 ML,于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 2) 培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200 ML的含有不同濃度待測(cè) 樣品的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并以PBS為陰性對(duì)照，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 3) 48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 W和新鮮基礎(chǔ)培 養(yǎng)基180 ML ;于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)； 4) 4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 W DMS0后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率： 癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%)=((對(duì)照組0D-空白組OD)-(給藥組0D-空白組OD))八（對(duì)照 組0D-空白組0D) )X100。
[0013] 應(yīng)用實(shí)施例1 腫瘤細(xì)胞MCF-7和H印G-2及人正常肝細(xì)胞L02各100 ML細(xì)胞懸液（5 X 104個(gè)/mL)， 加至96孔板中，于37 °C恒溫C0