一種利那洛肽的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽類藥物的純化方法，尤其是一種利那洛肽的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 利那洛肽（linaclotide)是由美國(guó)Ironwood公司研發(fā)的一種鳥苷酸環(huán)化酶 C(GC-C)激動(dòng)劑，于2012年8月30日獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，商品名為L(zhǎng)inzess。該藥為膠 囊劑，用于治療便秘腸易激綜合征（IBS-C)和慢性特發(fā)性便秘（CIC)，它是首個(gè)具有此種作 用機(jī)制的治療便秘的藥物。
[0003]利那洛肽是一個(gè) 14-氨基酸肽，序列為 Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala -Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-〇H( 1-6)，（2-10)，（5-13) _tris (disulfide)，為白色至灰白色無(wú)定 形粉末，微溶于水和氯化鈉水溶液（〇. 9%)。
[0004] 利那洛肽是一種鳥苷酸環(huán)化酶C激動(dòng)劑，它與腸道GC-C結(jié)合后，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)和細(xì) 胞外環(huán)鳥苷酸（cGMP)濃度升高。細(xì)胞內(nèi)cGMP升高可以刺激腸液分泌，加快胃腸道移行，從 而增加排便頻率；細(xì)胞外cGMP濃度升高會(huì)降低痛覺神經(jīng)的靈敏度、降低腸道疼痛。
[0005] 關(guān)于利那洛肽的純化工藝也很少有文獻(xiàn)報(bào)道。僅專利申請(qǐng)CN103848893A中提到 了以多孔石墨化碳為固定相，結(jié)合流動(dòng)相中加入一定濃度的Y -環(huán)糊精作立體選擇劑，采 用高效液相色譜法對(duì)利那洛肽粗肽進(jìn)行分離純化。Y _環(huán)糊精帶入純化體系，存在殘留風(fēng) 險(xiǎn)，并且該工藝成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 由于多對(duì)二硫鍵的存在，給利那洛肽的純化帶來(lái)較大困難，體現(xiàn)在：1.在合成利 那洛肽時(shí)，產(chǎn)生多種二硫鍵錯(cuò)配的雜質(zhì)，這類雜質(zhì)與產(chǎn)品很難分離，導(dǎo)致最終產(chǎn)品純度低； 2.由于多對(duì)二硫鍵的存在，導(dǎo)致利那洛肽分子立體結(jié)構(gòu)上與一般多肽差異很大，常用填料 很難得到純度較好的產(chǎn)品；3.多對(duì)二硫鍵在生產(chǎn)的過(guò)程中容易產(chǎn)生較多的多聚體，該多聚 體是最主要的雜質(zhì)之一，本身極不穩(wěn)定，易變色，嚴(yán)重影響利那洛肽的色澤、含量及安全性。 本發(fā)明人經(jīng)研究使用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行純化發(fā)現(xiàn)，難以將多聚體雜質(zhì)含量控制在0. 1%以下，同 時(shí)容易造成利那洛肽收率降低。
[0007] 本發(fā)明提供了一種利那洛肽的純化工藝，能夠很好地解決上述問(wèn)題，不僅可以得 到高收率、高純度的利那洛肽，而且能夠很好地將多聚體雜質(zhì)控制在〇. 1%以下，適合工業(yè) 化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有方法純化含有多對(duì)二硫鍵的多肽，具體為利那 洛肽，除雜困難，產(chǎn)品總收率低、純度低的問(wèn)題。
[0009] 通常使用反相高效液相色譜進(jìn)行多肽純化時(shí)，小孔徑的填料的比表面積較大，純 化效果更好。但在實(shí)際應(yīng)用中，我們發(fā)現(xiàn)含有多對(duì)二硫鍵的多肽在空間結(jié)構(gòu)上的特殊性，導(dǎo) 致其在小孔徑的填料上所獲得的有效比表面積反而比大孔徑填料的有效比表面積的小，多 聚體雜質(zhì)不易除去，純化效果不理想。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種利那洛肽的純化方法。該純化方法，使用了一定 范圍內(nèi)較大孔徑的填料，并在合適的制備條件下對(duì)利那洛肽進(jìn)行了純化。具體表現(xiàn)為， 200-300A孔徑的填料效果好，更進(jìn)一步得表現(xiàn)為，使用300A孔徑的填料效果更好，尤其是 針對(duì)多聚體雜質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義； Fmoc :荷甲氧羰基 Fmoc-AA :荷甲氧羰基保護(hù)的氨基酸 DIC :N，N'-二異丙基碳化二亞胺 HOBt :1_羥基苯駢三唑 tBu :叔丁基 Trt :三苯甲基 Cys :半胱氨酸 Glu :谷氨酸 Tyr :酪氨酸 Asn :天冬酰胺 Pro :脯氨酸 Ala :丙氨酸 Thr :蘇氨酸 Gly :甘氨酸 DMF :N，f -二甲基甲酰胺 MeOH :甲醇 DCM :二氯甲烷 TFA :三氟醋酸 EDT :乙二硫醇 PhSMe :苯甲硫醚 Piperidine :六氫P比啶 DIEA :N，f -二異丙基乙胺 為此本發(fā)明提供一種利那洛肽的純化方法，其特征包括以下步驟： (1) 使用三氟醋酸調(diào)節(jié)利那洛肽粗品溶液pH為3. 5±0. 2 ; (2) 按體積分?jǐn)?shù)設(shè)置梯度，使用50%流動(dòng)相B沖洗反相填料柱10min，然后用5%流動(dòng)相 B等度洗脫平衡10min ; (3) 將（1)溶液載入反相填料中； (4) 按體積分?jǐn)?shù)設(shè)置梯度，洗脫梯度的初始狀態(tài)流動(dòng)相B為5%，保持5分鐘，然后在1分 鐘內(nèi)將流動(dòng)相B比例增至16%，然后在80分鐘內(nèi)將流動(dòng)相B比例增至26%，收集洗脫餾分； (5) 將洗脫餾分經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)鹽、濃縮、凍干后得到利那洛肽精肽； 其中，反相填料柱為：（1〇 ym，200~300 A，50 mm X250 mm); 流動(dòng)相A 3%醋酸水溶液； 流動(dòng)相B:乙腈； 梯度程序?yàn)椋合疵撎荻鹊某跏紶顟B(tài)流動(dòng)相B為5%，保持5分鐘，然后在1分鐘內(nèi)將流動(dòng) 相B比例增至16%，然后在80分鐘內(nèi)將流動(dòng)相B比例增至26% ; 流速為：80 mL/min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)為：220 nm〇
[0012] 本發(fā)明提供的方法經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)篩選，從而獲得較為理想的實(shí)驗(yàn)條件如下： 1. 填料孔徑的選擇 填料孔徑：12〇A、20〇A、30〇A 2. 流動(dòng)相A類型選擇 0. 1%TFA水溶液、0. 3%醋酸水溶液 3. 填料類型選擇 硅膠C18反相填料、多聚體UniPS_| 10反相填料 針對(duì)利那洛肽的純化我們同樣進(jìn)行了以下5個(gè)實(shí)驗(yàn)條件： 實(shí)驗(yàn)條件1 :(1)樣品處理：將利那洛肽粗肽溶液，用TFA調(diào)節(jié)pH為3. 5±0. 5 ;(2) 沖柱、平衡：使用50%流動(dòng)相A沖洗反相填料柱lOmin ;然后用5%流動(dòng)相A等度洗脫平衡 lOmin;其中，硅膠C18反相填料柱為（10 ym，12〇A，50 _ X250 mm);流動(dòng)相A:0. 1%TFA水 溶液；流動(dòng)相B :乙腈；（3)上樣：將樣品溶液載入制備柱中；（4)洗脫：梯度程序?yàn)椋合疵?梯度的初始狀態(tài)流動(dòng)相B為5 %，保持5 min，然后lmin內(nèi)將流動(dòng)相B比例增至16 %，再然 后80 min內(nèi)將流動(dòng)相B比例增至26% ;流速為：80 mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm ;中控檢測(cè)： 用 Agilent ZORBAX Bonus RP 5um 4.6*250mm色譜柱；以 10mM磷酸二氫鉀磷酸調(diào) pH2.1 為 流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B ;流速為1.0ml/min ;柱溫為30 °C;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm ;洗脫梯度 的初始狀態(tài)為20 %流動(dòng)相B，在40 min內(nèi)將流動(dòng)相B升至40 %，然后在5 min內(nèi)將流動(dòng) 相B升至70 %，在2min內(nèi)回到初始狀態(tài)，保持13min ; (5)轉(zhuǎn)鹽、濃縮、凍干后得到利那洛 肽精肽。
[0013] 實(shí)驗(yàn)條件2- 8,實(shí)驗(yàn)操作如實(shí)驗(yàn)條件1所示，各實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
以上結(jié)果表明，填料孔徑200A-300A的純化效果好，300A的純化效果最理想。
[0014] 對(duì)同樣的利那洛肽粗肽進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，使用現(xiàn)有技術(shù)CN103848893A中的純化 工藝和本發(fā)明的較優(yōu)方法分別如實(shí)施例4和實(shí)施例5所示，本發(fā)明的較優(yōu)方法具有顯著優(yōu) 勢(shì)，有關(guān)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
本發(fā)明的有益效果是：提供了一種高純度、高收率以及低成本的利那洛肽純化方法，其 中特別可以很好的控制多聚體雜質(zhì)。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1利那洛肽精肽HPLC譜圖。
[0016] 圖2利那洛肽精肽多聚體檢測(cè)譜圖。
[0017] 圖3利那洛肽質(zhì)譜譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0019] 具體地，關(guān)于下面實(shí)施例中涉及的各商購(gòu)氨基酸以及氨基酸片段，以及各商購(gòu)樹 月旨，其生產(chǎn)廠家和商品型號(hào)如下： Fmoc保護(hù)基氨基酸原料、2-CTC樹脂均為常規(guī)的市售試劑(廠家：吉爾生化(上海）有限 公司；化學(xué)純)。
[0020] 有機(jī)溶劑和其它原料來(lái)源均為市售品（廠家：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；化學(xué) 純)。
[0021] 純化填料：Daisogel SP_2〇〇-l〇-P，Daisogel SP_3〇〇-l〇-P，蘇州納微 UniPS:f) 10。
[0022] 另外，下面實(shí)施例中提到的"旋蒸濃縮"以及"凍干"以及測(cè)定HPLC和質(zhì)譜的條件 和所用設(shè)備型號(hào)及生產(chǎn)廠家說(shuō)明如下： 制備HPLC :創(chuàng)新通恒、Waters 2545 ; 旋蒸濃縮設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-200/205 (瑞士 Buchi (布奇）公司）； 旋蒸濃縮條件：30°C下，真空（-0.1 Mpa)條件下旋蒸濃縮，濃縮后體積在旋蒸前總體積 75%以下。
[0023] 凍干設(shè)備：凍干機(jī)FD-3 (北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）； 凍干條件：將凍干盤放入冰箱冷凍室（-20°C)中，預(yù)凍6 h。開啟凍干機(jī)，打開制冷， 預(yù)冷30 min以上，設(shè)置凍干曲線如下： 第一段：在-27 °C運(yùn)行16 h ;第二段：在-5°C運(yùn)行4 h ;第三段：在5°C運(yùn)行2 h ;第四 段：在30°C運(yùn)行16 h。
[0024] HPLC :Agilent ZORBAX Bonus RP 5um 4. 6*250mm 色譜柱；以 lOmM 磷酸二氫鉀（磷 酸調(diào)pH2. 1)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B ;流速為1.0ml/min ;柱溫為30 °C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為 210 nm ;洗脫梯度的初始狀態(tài)為20 %流動(dòng)相B，在40 min內(nèi)將流動(dòng)相B升至40 %，然后 在5 min內(nèi)將流動(dòng)相B升至70 %，在2min內(nèi)回到初始狀態(tài)，保持13min。
[0025] 凝膠色譜（多聚體檢測(cè)）：色譜柱：TSK GEL 2000 SWXL 5ym 7. 8*300mm;流動(dòng)相： TFA:乙腈：水=0. 05 :35 :65 ;柱溫：30°C;流速：0. 8ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm ;梯度：等度洗 脫30分鐘。
[0026] 實(shí)施例1:利那洛肽的固相合成 稱取取代度為1. 50mmol/g的2-CTC樹脂66. 67g，加入到固相反應(yīng)柱中， 加入到固相反應(yīng)柱中，用DCM洗滌1次，用DCM溶脹樹脂30分鐘后，取229. 76g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(500mmol)用 DMF 溶解，冰水浴下加入 124ml DIEA(750mmol)活化后，加 入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，反應(yīng)2小時(shí)后，加入1000ml無(wú)水甲醇封閉1小時(shí)。用DMF洗滌3 次，得到Fmoc-Tyr (tBu) -CTC樹脂。用DMF:吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護(hù)，然 后用 DMF 洗滌 6 次，稱取 175. 72g Fmoc-Cys(Trt)-OH(300mmol)、40. 52g H0Bt(300mmol)加 入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入46ml DIC(300mmol)活化后，加入上 述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，以茚三酮法檢測(cè)判斷反應(yīng)終點(diǎn)，如果樹脂無(wú) 色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時(shí)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適 用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測(cè)判斷反應(yīng)終點(diǎn)。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相 應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照利那洛肽主鏈肽序，依次完成Fm 〇C-Gly-OH、Fm〇C-Thr (tBu) -OH、 Fmoc-Cys(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt