特異性結(jié)合lmp2a胞外區(qū)第二位及第五位串聯(lián)表位融合蛋白的單克隆抗體及應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】特異性結(jié)合LMP2A胞外區(qū)第二位及第五位串聯(lián)表位融合蛋白的單克隆抗體及應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)和免疫靶向診療領(lǐng)域，具體涉及抗EBV潛伏膜蛋白LMP2A單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]鼻咽癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)生于鼻咽腔或者上咽喉部，發(fā)病率高，好發(fā)于中國(guó)華南地區(qū)。16?25歲前后與45?54歲是鼻咽癌好發(fā)的兩個(gè)年齡段，發(fā)病對(duì)象主要為中青年。其發(fā)病原因與EBV感染密切相關(guān)，鼻咽癌病理檢查多為低分化型鱗癌，目前治療方案首選放療、化療，但是治療后五年生存率約為50%?60%，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，尤其復(fù)發(fā)后病人對(duì)放化療的敏感性大大降低。因此分子靶向治療為鼻咽癌的治療提供了更好的思路與方案。
[0005]EB病毒(Epstein-Barr virus, H5V)屬人類(lèi)γ皰疫病毒，在全球廣泛分布，約95%以上的成人所攜帶，呈潛伏感染狀態(tài)，與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。在EBV潛伏感染的細(xì)胞中，表達(dá)十多種EBV基因產(chǎn)物，包括EBV核抗原(EB nuclearantigen，EBNA) 1、2、3A、3B、3C 和 LP，潛伏膜蛋白(latent membrane protein，LMP) I 和 2A、2B，EBV編碼的小RNA(EBER) I和2以及的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。近年許多關(guān)于LMP2A的研究報(bào)道指出，EBV潛伏感染的B細(xì)胞中均有LMP2A的表達(dá)，鼻咽癌和其他EBV相關(guān)惡性腫瘤中可持續(xù)檢測(cè)到LMP2A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物(mRNA)，LMP2A可在沒(méi)有BCR提供信號(hào)的情況下促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和存活，并且LMP2A是鼻咽癌、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的EBV保守抗原，在維持病毒的潛伏感染狀態(tài)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并參與調(diào)節(jié)跨膜信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前認(rèn)為L(zhǎng)MP2A是鼻咽癌等EBV相關(guān)惡性腫瘤免疫治療的理想靶抗原。
[0006]由于迄今為止，對(duì)容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌沒(méi)有找到一種行之有效的治療方案，盡管多數(shù)患者采用放化療等綜合治療后病情有所好轉(zhuǎn)，但是5年后生存率仍然很不理想，并且極易復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，尤其是復(fù)發(fā)后的病人對(duì)放化療的敏感性大大降低。然而，鼻咽癌與其他頭頸腫瘤最顯著的區(qū)別在于與EBV高度相關(guān)，高轉(zhuǎn)移性。幾乎所有的鼻咽癌患者以及癌細(xì)胞都攜帶LMP2A mRNA, 50%以上的鼻咽癌腫瘤組織切片中檢測(cè)到LMP2A蛋白的表達(dá)。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]解決的技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合LMP2A胞外區(qū)第二位及第五位串聯(lián)表位融合蛋白的單克隆抗體及應(yīng)用，是一種能夠特異性識(shí)別LMP2A抗原的鼠源性單克隆抗體，該抗體對(duì)LMP2A蛋白的選擇性強(qiáng)。
[0009]技術(shù)方案:一種特異性結(jié)合LMP2A胞外區(qū)第二位及第五位串聯(lián)表位融合蛋白的單克隆抗體，由保藏編號(hào)為CCTCC N0:C201504的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，保藏日期為2015年I月29日，保藏單位名稱(chēng)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。
[0010]一種抗LMP2A雜交瘤細(xì)胞株5C12C4A6，其保藏編號(hào)為CCTCC NO: C201504，保藏日期為2015年I月29日，保藏單位名稱(chēng)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。
[0011]所述的單克隆抗體在制備用于檢測(cè)LMP2A胞外區(qū)第二位及第五位串聯(lián)表位融合蛋白的免疫檢測(cè)工具中的應(yīng)用。
[0012]所述免疫檢測(cè)工具為試劑盒、芯片或試紙。
[0013]所述的單克隆抗體在制備用于診斷LMP2A胞外區(qū)第二位及第五位串聯(lián)表位融合蛋白相關(guān)性腫瘤的病理診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0014]所述相關(guān)腫瘤為鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌或T細(xì)胞淋巴瘤。
[0015]一種免疫組化試劑盒，包括上述的單克隆抗體。
[0016]有益效果:本發(fā)明的檢測(cè)方法是利用單克隆抗體專(zhuān)一性，特異性強(qiáng)，靈敏度高的特征，基于研究證實(shí)LMP2A在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中的重要作用的基礎(chǔ)上。運(yùn)用LMP2A胞外區(qū)第二位第五位表位串聯(lián)融合蛋白免疫小鼠，制備出單克隆抗體，可以特異性靶向結(jié)合鼻咽癌中LMP2A蛋白，結(jié)合病理診斷，可以預(yù)測(cè)病人的病情發(fā)展及預(yù)后，更重要的是將LMP2A作為靶點(diǎn)，在鼻咽癌治療方面起到重要作用。同時(shí)，基于LMP2A在其它EBV相關(guān)腫瘤中的作用，例如Hodgkin淋巴瘤、胃癌、T細(xì)胞淋巴瘤等，對(duì)此類(lèi)EBV相關(guān)腫瘤的檢測(cè)，診斷以及治療發(fā)揮一定作用。利用單克隆抗體特異性中和LMP2A從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)其誘導(dǎo)的EMT轉(zhuǎn)變，抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移；利用單克隆抗體介導(dǎo)的靶向特性，連接化療藥物以及放療增敏劑，達(dá)到了靶向治療的目的。
[0017]
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為純化后的抗LMP2A單克隆抗體的SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0019]圖2為間接ELISA測(cè)定抗LMP2A單克隆抗體效價(jià)結(jié)果。
[0020]圖3為抗LMP2A單克隆抗體Western blot免疫印跡結(jié)果。
[0021]圖4為抗LMP2A單克隆抗體流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。
[0022]圖5為抗LMP2A單克隆抗體細(xì)胞免疫熒光分析結(jié)果。
[0023]圖6為抗LMP2A單克隆抗體免疫組化分析結(jié)果。A.鼻咽癌病例I ;B.鼻咽癌病例2;C.鼻咽癌病例3; D.無(wú)關(guān)抗體；E.SP2/0細(xì)胞腹水；F.PBS陰性對(duì)照
【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0024]實(shí)施例1
抗LMP2A單克隆抗體的制備與鑒定:
1.抗原免疫抗原乳化:弗氏完全佐劑預(yù)先微加熱，用注射器吸200 μ L移入I mL滅菌EP管，滴入200 μ L純化后的LMP2A胞外區(qū)表位串聯(lián)融合蛋白，邊滴邊搖至乳化完全，接種小鼠。初次免疫小鼠使用弗氏完全佐劑，之后免疫均使用弗氏不完全佐劑。其中佐劑和蛋白的量是1:1。
[0025]初次免疫:200 μ L LMP2A抗原(100 μ g)與等量福氏完全佐劑混合后，200 μ L/只頸背部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠并做好標(biāo)記；
加強(qiáng)免疫:同劑量的抗原與福氏不完全佐劑混合，隔周免疫，免疫方法同上，加強(qiáng)兩次；
末次免疫:融合前三天，眼眶取血，測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)，對(duì)效價(jià)高的小鼠進(jìn)行再次加強(qiáng)免疫，取等量抗原不加佐劑腹腔加強(qiáng)免疫。
[0026]2.骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞的準(zhǔn)備
骨髓瘤細(xì)胞:融合前兩周復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，用20%FBS的PRM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞并即時(shí)傳代，待骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、形態(tài)良好時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0027]小鼠脾細(xì)胞:
I)末次免疫后三天的小鼠，對(duì)其眼眶取血，保留血清樣本。
[0028]2)斷頸處死小鼠，泡入75%酒精中待用。
[0029]3)事先準(zhǔn)備好的高壓滅菌的手術(shù)剪刀，在超凈臺(tái)內(nèi)將小鼠固定，剪開(kāi)小鼠腹膜，取出脾臟后放置于已加入1mL不完全培養(yǎng)基的平皿中，洗滌脾臟，并小心剝?nèi)ブ車(chē)Y(jié)締組織。
[0030]4)將洗滌后的脾臟置入另一個(gè)平皿中，加入1mL不完全培養(yǎng)基，用彎頭鑷子輕輕擠壓脾臟，使得脾細(xì)胞溢出，將溢出的脾細(xì)胞溶液吸入離心管中。
[0031]5)再將脾臟置于銅網(wǎng)上，用注射器內(nèi)柄擠壓研磨脾細(xì)胞，并用不完全培養(yǎng)基沖洗銅網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液，與之前的脾細(xì)胞溶液合并轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。
[0032]6)將細(xì)胞懸液離心，轉(zhuǎn)速為1000 rpm離心5 min，棄去上清，1640培養(yǎng)基重懸洗滌后再次離心，轉(zhuǎn)速為1000 rpm離心5 min。
[0033]7)脾細(xì)胞沉淀用10 mL培養(yǎng)基重懸，取脾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后備用。
[0034]
3.小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合
I)分別取I X 18個(gè)脾細(xì)胞與2X10 7個(gè)SP2/0細(xì)胞于兩個(gè)離心管中，再將它們一起轉(zhuǎn)入另一個(gè)50 mL離心管中混合，用1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，I 000 rpm離心5 min，重復(fù)兩次，
上清盡量棄干凈。
[0035]2)離心管底部輕輕擊打手掌，使沉淀在離心管底部的細(xì)胞松散均勻。
[0036]3)取出事先放在37°C孵育箱中的PEG，用膠頭吸管在60 s內(nèi)向離心管中加入0.7mL PEG，注意邊加邊均勻轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，動(dòng)作輕柔。
[0037]4)置入37°C孵育箱中靜置90 s后，取出，30 s內(nèi)加入I mL 1640培養(yǎng)基，邊加邊輕輕搖晃；再加入3 mL培養(yǎng)基，邊加邊輕晃；再在5min內(nèi)加入10 mL培養(yǎng)基，邊加邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管。
[0038]5)用培養(yǎng)基補(bǔ)至40 mL，靜置5 min后，800 rpm 5 min，棄上清。用含20%新生牛血清以及I X HAT的選擇培養(yǎng)基10 mL重懸沉淀，100 μ L /孔滴加入96孔板中，共鋪10塊板。置于37 °C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0039]6)每隔3至4天HAT培養(yǎng)基用量減半換液，培養(yǎng)10天以后改用HT培養(yǎng)基，2周后改用含20%新生牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0040]7)每天觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
[0041]
4.陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選
I)待克隆形成10~14天后對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行整板間接ELISA檢測(cè)，從而快速?gòu)拇罅縀SLISA板中篩選陽(yáng)性克隆。
[0042]2)PBS稀釋LMP2A融合蛋白為I yg/mL包板，4 °C過(guò)夜，第二天甩去包被液，用PBST清洗ELISA板3次，切勿對(duì)準(zhǔn)孔底沖洗；
3)新鮮配制5%脫脂奶粉，0.3mL/孔室溫封閉2 h，甩去孔中封閉液，PBST清洗兩遍；
4)加入待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽(yáng)性小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。37°C培養(yǎng)箱2 h ；
5)PBST 清洗 3 遍，3 min/ 遍；
6)加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1:2000稀釋)，37°C培養(yǎng)箱Ih;
7)PBST 清洗 6 遍，3 min/遍，加入 TMB-H2O2底物，室溫顯色 5-10 min, 0.2 mol/L H2SO4終止；
8)酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)，保存數(shù)據(jù)。
[0043]9)取兩次篩選均為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞孔，繼續(xù)克隆化培養(yǎng)。
[0044]
5.有限稀釋法
I)將待亞克隆孔的雜交瘤細(xì)胞消化，收集在離心管中用膠頭滴管制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含10%FBS的HT培養(yǎng)基梯度稀釋至50個(gè)/mL和10個(gè)/mL，100 μ L /孔加入96孔板中，如此細(xì)胞數(shù)量平均約含5個(gè)/孔和I個(gè)/孔，補(bǔ)培養(yǎng)基10yL /孔，37 °C，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)；復(fù)篩兩次。
[0045]2)每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，即時(shí)更換培養(yǎng)基。
[0046]3)選擇呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)、形態(tài)良好的細(xì)胞繼續(xù)克隆，至抗體分泌孔陽(yáng)性率為100%。
[0047]4)擴(kuò)大培養(yǎng)并即時(shí)凍存細(xì)胞株。
[0048]
6.單克隆抗體的制備與純化制備單克隆抗體:
(I)雜交瘤細(xì)胞以I X 17個(gè)/mL (體積為2