一種集提取、擴(kuò)增和檢測(cè)一體化的基因檢測(cè)裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的普通領(lǐng)域，尤其涉及在一便攜式裝置中提取核酸，擴(kuò)增特異的靶核酸并檢測(cè)擴(kuò)增核酸序列的方法的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]由于對(duì)傳染病和新出現(xiàn)疾病、生物威脅試劑、遺傳病和致病因子的環(huán)境儲(chǔ)庫(kù)的公共健康影響和認(rèn)識(shí)已經(jīng)增加了，因此，對(duì)于更加信息化、靈敏和特異性的使用快速測(cè)定的需求已使得對(duì)檢測(cè)樣本工具的要求增加。目前，通過(guò)傳統(tǒng)的核酸提取方法提取核酸，通過(guò)PCR的擴(kuò)增的方法進(jìn)行的分子檢測(cè)是非常靈敏的、特異性的和信息化的。不幸的是，目前可用的提取核酸和核酸檢測(cè)方法不適合在取樣現(xiàn)場(chǎng)使用或在取樣現(xiàn)場(chǎng)使用的實(shí)用性有限，原因在于其需要精巧的、笨重且昂貴的儀器、專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室材料和/或依賴于使用者干預(yù)的多個(gè)操作。因此，大部分用于分子檢測(cè)的樣品被裝運(yùn)到集中式實(shí)驗(yàn)室，這導(dǎo)致獲得所需要的信息需要長(zhǎng)的周轉(zhuǎn)時(shí)間。
[0003]盡管目前研究開(kāi)發(fā)了一些涉及檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列自動(dòng)化系統(tǒng)，但目前的技術(shù)包括三個(gè)步驟。
[0004]第一步，核酸提取:
1869年，瑞士醫(yī)師Friedrich Miescher首例成功的進(jìn)行了核酸提取。起初，他關(guān)注于組成白細(xì)胞各種蛋白質(zhì)，并指出蛋白質(zhì)是細(xì)胞質(zhì)的主要成分。但在隨后的測(cè)試試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入酸性溶液時(shí)溶液中生成一種沉淀物，再加入堿性溶液時(shí)沉淀繼而溶解消失。Miescher首例提取出粗糙的DNA，Miescher成功從細(xì)胞中提取出DNA后，一些研究者紛紛效仿，并在材料、試劑的應(yīng)用上進(jìn)行了不斷的探索，由此發(fā)展了許多核酸的生物分子提取技術(shù)。現(xiàn)如今，從硫氰酸胍鹽-苯酚-氯仿提取法到柱純化技術(shù)，已被廣泛地用于DNA和RNA的提取。提取方法主要包括以下幾種:
1.胍鹽裂解法
胍鹽是蛋白強(qiáng)變性劑，核酸提取一般采用高濃度的胍鹽來(lái)裂解細(xì)胞，促使核蛋白體解離，同時(shí)高濃度的胍鹽能使細(xì)胞內(nèi)核酸酶失活，使釋放出的核酸不被降解。1977年，Ulrich等首次使用異硫氰酸胍從總RNA中分離純化出mRNA。該方法特點(diǎn)是利用多數(shù)真核細(xì)胞中mRNA的3’端有polyA尾巴，使用oligo (dT)—纖維素親和層析法，從總RNA中分離純化出mRNA，但此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。在Ulrich研究的基礎(chǔ)上，1979年Chirgwin等[4]發(fā)明了一種破裂細(xì)胞膜但不破壞核苷酸的方法，即先將組織在異硫氰酸胍和β -巰基乙醇中混合均勻，然后通過(guò)乙醇抽提或氯化銫梯度超速離心來(lái)分離純化細(xì)胞中的RNA。該技術(shù)是首次能特異性分離RNA的方法，但還是存在諸多缺點(diǎn)，比如耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有機(jī)溶劑，操作有一定的風(fēng)險(xiǎn)性。到目前為止，雖然在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了很多核酸提取技術(shù)，但均沒(méi)有克服耗時(shí)長(zhǎng)、危險(xiǎn)性大等諸多弊端。
[0005]2.CTAB 裂解法
1980年，Murray和Thompson發(fā)明了一種方法:使用溴化十六燒基三甲基錢(CTAB)法可快速提取高純度的大分子量植物DNA。經(jīng)液氮研磨樣品后，用適當(dāng)體積的CTAB緩沖液重溶樣品。CTAB是一種非離子型去垢劑，它能使核酸和酸性的多糖從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀出來(lái)。同時(shí)，蛋白質(zhì)和中性多糖等雜質(zhì)留在溶液中。CTAB裂解法對(duì)產(chǎn)生大量多糖的生物體的核酸提純非常有用的，如植物和某些革蘭氏陰性菌，但這種方法的缺點(diǎn)是:實(shí)驗(yàn)步驟多，操作較繁瑣。
3.酸抽提法
苯酚作為蛋白變性劑，能使蛋白質(zhì)快速變性，因此，可用來(lái)提取基因組DNA:先用EDTA和SDS為主的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，再經(jīng)蛋白酶K處理后，然后用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理，獲得所需的核酸DNA0此法的優(yōu)點(diǎn)是提取的DNA保持天然狀態(tài)，且純度高，可滿足臨床各種檢測(cè)所需；缺點(diǎn)是操作繁瑣，比較費(fèi)時(shí)，而且使用毒性有機(jī)溶劑苯酚對(duì)試驗(yàn)人員有一定的危害。
[0006]由上所述，現(xiàn)有技術(shù)提取核酸存在實(shí)驗(yàn)步驟多、操作較繁瑣、危險(xiǎn)性大等缺點(diǎn)。
[0007]第二步，靶核酸擴(kuò)增:
核酸研究已有100多年的歷史，20世紀(jì)60年代末、70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，1983年美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis驅(qū)車在蜿蜒的州際高速公路上行駛，孕育出了 PCR的雛形。經(jīng)過(guò)兩年的努力，在實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了 PCR的構(gòu)想，并于1985年申請(qǐng)了有關(guān)PCR的第一個(gè)專利，在science雜志上發(fā)表了第一篇PCR學(xué)術(shù)論文。從此PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同。Kary Mullis也因此獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
[0008]PCR技術(shù)本身非常簡(jiǎn)單，且能最大限度地滿足生物學(xué)家操作DNA的不同要求。PCR技術(shù)又以驚人的速度發(fā)展，并滲透到各生物學(xué)分支科學(xué)和臨床各科的速度也令其它生物技術(shù)望而生嘆。PCR在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、生命科學(xué)、生物工程、遺傳工程、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等許多科學(xué)領(lǐng)域中都具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并對(duì)已建立的基因克隆、DNA序列分析等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展起到巨大的推動(dòng)作用。PCR能提供基因物質(zhì)的十分可信的精確分析，比任何現(xiàn)有技術(shù)敏感I萬(wàn)到100萬(wàn)倍。有人預(yù)測(cè)，21世紀(jì)為生物世紀(jì)，那么PCR便是生物世紀(jì)最重要的技術(shù)。
[0009]在DNA擴(kuò)增方面，PCR 一直是應(yīng)用最廣泛的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)有較高的靈敏度與特異性，并且易于操作。如TaqMan就是采用這種技術(shù)，兩端分別標(biāo)記有熒光與淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針結(jié)合到PCR產(chǎn)物上后，其淬滅基團(tuán)被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶切掉，從而產(chǎn)生熒光，通過(guò)對(duì)熒光的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)生定性和定量。其缺點(diǎn)是，需要昂貴的檢測(cè)熒光的儀器，對(duì)操作人員的要求較高。
[0010]第三步，靶核酸檢測(cè):
PCR產(chǎn)物一般為1013拷貝/ml，取0.1ml即為109拷貝，而Img人基因組DNA才含
1.4X106拷貝的單拷貝基因片段，因此使得PCR擴(kuò)增反應(yīng)具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，提高了檢測(cè)的敏感性。PCR反應(yīng)具有強(qiáng)大的擴(kuò)增效率，也正是其易污染的原因，極微量的污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。因此，PCR檢測(cè)微量感染因子時(shí)，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問(wèn)題，對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室尤應(yīng)如此。所以如何消除PCR假陽(yáng)性結(jié)果則成了科研工作者們要解決的一大難題。
[0011]在臨床上檢測(cè)擴(kuò)增的核酸非常大的依賴于擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交和應(yīng)用各種酶和發(fā)光試劑標(biāo)記的探針的檢測(cè)。這些技術(shù)要求多種試劑，若干洗滌步驟及檢測(cè)靶核酸的特殊裝置。另外，這些技術(shù)勞動(dòng)強(qiáng)度大并要求具有分子生物學(xué)專門知識(shí)的技術(shù)人員。
[0012]核酸檢測(cè)自動(dòng)化方案不需要專門訓(xùn)練的人員，但設(shè)備非常昂貴且由于許多樣本將由同一個(gè)設(shè)備加工因而仍可能存在污染。綜上所述，由于現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法需要大型儀器以及擴(kuò)增產(chǎn)物容易造成污染的缺陷，使得提取核酸進(jìn)行擴(kuò)增的診斷受到了很大的限制。
[0013]因此，如何克服上述缺陷成為本領(lǐng)域需要解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不方便攜帶儀器，且需對(duì)樣品依次分步的進(jìn)行提取、擴(kuò)增、檢測(cè)，步驟繁瑣且不能直接觀察檢測(cè)結(jié)果的缺陷，提供一種對(duì)靶核酸進(jìn)行快速提取、擴(kuò)增及檢測(cè)一體化的便攜式裝置。
[0015]本發(fā)明是一種便攜式裝置，其在一個(gè)裝置內(nèi)綜合了核酸提取，特異的靶核酸擴(kuò)增及檢測(cè)，使得核酸檢測(cè)能迅速而準(zhǔn)確的進(jìn)行。本裝置可用于所有核酸及其衍生物。本發(fā)明可用于鑒別相應(yīng)于某些疾病的特異性核酸序列，并檢測(cè)傳染性疾病的治療療效，但不限于這些用途。
[0016]在本發(fā)明中，此便攜式裝置包括兩個(gè)位于相鄰位置的長(zhǎng)圓筒，兩個(gè)圓筒通過(guò)可壓縮的彈性物質(zhì)密封相連且能相對(duì)上下壓縮。樣本導(dǎo)入第一個(gè)圓筒進(jìn)行裂解消化，裂解消化后得到的混合物經(jīng)過(guò)過(guò)濾系統(tǒng)過(guò)濾，過(guò)濾后得到