一株產(chǎn)阿魏酸酯酶的噬淀粉乳桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一株產(chǎn)阿魏酸醋酶的隧淀粉乳桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隧淀粉乳桿菌是一種具有淀粉水解活性的乳酸細(xì)菌，其產(chǎn)生的解淀粉酶具有淀粉 酶和支鏈淀粉酶的雙重活性，因此隧淀粉乳桿菌可W直接轉(zhuǎn)化復(fù)雜的淀粉質(zhì)底物生成乳 酸。目前從自然環(huán)境中分離篩選出利用淀粉為碳源生產(chǎn)乳酸的隧淀粉乳桿菌成為乳酸發(fā)酵 研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0003] 阿魏酸醋酶是一類能夠降解植物細(xì)胞壁中阿魏酸與木質(zhì)素或阿拉伯半糖相交聯(lián) 的醋鍵的水解酶。阿魏酸醋酶同其它纖維素酶如木聚糖酶、阿拉伯糖巧酶等具有協(xié)同作用， 共同作用于植物細(xì)胞壁時(shí)，能提高細(xì)胞壁的降解效率。利用阿魏酸醋酶，可W降低生產(chǎn)工藝 中采用化學(xué)法所帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題。同時(shí)，阿魏酸醋酶水解細(xì)胞壁釋放的阿魏酸是一種 天然的抗氧化劑，可W清除細(xì)胞內(nèi)的自由基。鑒于阿魏酸醋酶的上述優(yōu)點(diǎn)，它在造紙、紡織、 食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用。
[0004]目前阿魏酸醋酶主要來(lái)源于微生物，不同微生物所產(chǎn)生的阿魏酸醋酶各具特性， 它們?cè)诰幋a序列、氨基酸結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)和及催化特性上都有所差異。已報(bào)道的菌株其 阿魏酸醋酶的產(chǎn)量均較低，無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)。因而篩選獲得新的阿魏酸醋酶產(chǎn)生菌株 仍有很大的必要性。
[0005] 飼料青膽技術(shù)的研究及應(yīng)用已有上百年的歷史。青膽飼料是將含水率為65%-75%的青綠賴桿切碎后，在密閉絕氧的條件下，通過(guò)乳酸菌的厭氧發(fā)酵作用，抑制各種雜菌 的繁殖，而得到的一種粗飼料。青膽飼料氣味酸香、柔軟多汁、適口性好、營(yíng)養(yǎng)豐富、利于長(zhǎng) 期保存，是家畜優(yōu)良飼料來(lái)源。青膽飼料對(duì)草食動(dòng)物，尤其是對(duì)奶牛已成為不可缺少的常規(guī) 飼料。目前在青膽過(guò)程中，除乳酸菌外還會(huì)添加淀粉酶和纖維素酶等青膽酶制劑。淀粉酶 可W降解賴桿中的淀粉，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供可溶性碳源，并且代謝產(chǎn)生的乳酸可W 對(duì)其它微生物起到抑制作用。鑒于阿魏酸醋酶降解植物細(xì)胞壁中交聯(lián)的阿魏酸基團(tuán)后，更 有利于其它纖維素酶作用的發(fā)揮，相互協(xié)同下提高對(duì)賴桿的利用率，開(kāi)發(fā)或篩選具有淀粉 酶和阿魏酸醋酶產(chǎn)生能力的乳桿菌，在降解淀粉的同時(shí)增強(qiáng)纖維素的水解能力，W滿足對(duì) 青膽飼料發(fā)酵的要求成為目前研究課題的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵青膽飼料菌株特性不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一株產(chǎn)阿魏酸 醋酶的隧淀粉乳桿菌及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的產(chǎn)阿魏酸醋酶的隧淀粉乳桿菌，其特征在于：所述菌株命名為隧淀 粉乳桿菌化actobacillusamylovorus)。，該菌株已于2015年7月6日保藏于"中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、"，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.11056。
[0008] 上述隧淀粉乳桿菌化actobacillusamylovorus)C分離自山東青膽發(fā)酵玉米 飼料中，是一株能夠產(chǎn)生阿魏酸醋酶的瞻淀粉乳桿菌，具有瞻淀粉乳桿菌的典型特征，即 為：革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧，無(wú)芽抱，不運(yùn)動(dòng)；菌藩較小且大小均一，邊緣整齊，乳白色；細(xì)胞 呈長(zhǎng)桿狀，單個(gè)出現(xiàn)或呈短鏈，1.OUmX3. 0-5.OUm;上述日籃淀粉乳桿菌（Xactobacillus amylovorus)c的生理生化特征詳見(jiàn)表Io
[0009] 表1 :上述日籃淀粉乳桿菌（Xactobacillusamylovorus)C的生理生化特征
[0010]
[0011] CN105154371A 說(shuō)明書 4/7 頁(yè)
[0012] 上述隧淀粉乳桿菌（Xactobacillus amylovorus)CCGMCCNo.11056 生長(zhǎng)溫度為 25-42°C，最適生長(zhǎng)溫度為37°C。
[0013] 上述隧淀粉乳桿菌（Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 在MRS培養(yǎng) 基中生長(zhǎng)，靜置培養(yǎng)12小時(shí)后，菌體密度達(dá)到5. 74,抑值為4. 12。
[0014] 上述MRS培養(yǎng)基的配方：膜蛋白腺10.Og,牛肉膏10.Og,酵母粉5g，葡萄糖20.Og, 巧樣酸S錠2.Og,硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 25g，乙酸鋼3. 12g，憐酸氨二鋼1. 63g，乙酸鐘 2. 25g，吐溫-801. 0血，蒸饋水1000血，固體需加瓊脂20.Og, 115°C滅菌30分鐘。
[0015] 上述隧淀粉乳桿菌（Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 在含淀粉培 養(yǎng)基固體平板中37°C靜置培養(yǎng)48小時(shí)，形成的淀粉水解圈如圖1所示；在含淀粉培養(yǎng)基液 體試管中37°C靜置培養(yǎng)48小時(shí)，菌體密度可達(dá)到6. 26,抑值降至3. 92,上清液處理淀粉2 小時(shí)后還原糖含量達(dá)到0. 6mg/血。
[0016] 上述含淀粉培養(yǎng)基配方為：膜蛋白腺10.Og,牛肉膏10.Og,酵母粉5g，可溶性淀粉 10.Og,巧樣酸S錠2.Og,硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 25g，乙酸鋼3. 12g，憐酸氨二鋼1. 63g，乙 酸鐘2. 25g，吐溫-801. 0血，蒸饋水1000血，固體需加瓊脂20.Og, 115°C滅菌30分鐘。
[0017] 上述隧淀粉乳桿菌（Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 在含阿魏酸 乙醋培養(yǎng)基固體平板中37°C靜置培養(yǎng)72小時(shí)，菌株產(chǎn)阿魏酸醋酶水解阿魏酸乙醋形成的 透明圈如圖2所示；在含阿魏酸乙醋培養(yǎng)基液體試管中37°C靜置培養(yǎng)72小時(shí)，檢測(cè)阿魏酸 醋酶酶活到達(dá)420mU每毫克蛋白。
[0018] 上述含阿魏酸乙醋培養(yǎng)基配方為：膜蛋白腺10.Og,牛肉膏10.Og,酵母粉5g，10% (W/V)阿魏酸乙醋的DMSO溶液15血，巧樣酸S錠2.Og，硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 25g，乙酸 鋼3. 12g，憐酸氨二鋼1. 63g，乙酸鐘2. 25g，吐溫-801. 0血，蒸饋水1000血，固體需加瓊脂 20. 0g，115°C滅菌 30 分鐘。
[0019] 將本發(fā)明的隧淀粉乳桿菌（Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 1105616S rDNA基因序列與有關(guān)菌株的16SrDNA基因序列比較，雖有相似性，但卻不完全相同，說(shuō)明 本發(fā)明的菌株是首次分離鑒定，具有原創(chuàng)性。
[0020] 本發(fā)明所述產(chǎn)阿魏酸醋酶的隧淀粉乳桿菌在制備發(fā)酵青膽飼料中的應(yīng)用。
[0021] 其中：所述產(chǎn)阿魏酸醋酶的隧淀粉乳桿菌在含淀粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能產(chǎn)生淀粉酶， 在含阿魏酸乙醋培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能產(chǎn)生阿魏酸醋酶，將其按每千克物料為1.OXIO6C化的菌 數(shù)接種量混合于青綠賴桿物料中，常溫密閉發(fā)酵45天或W上，即獲得每千克干物質(zhì)乳酸含 量20. 49gW上的青膽飼料。
[0022] 優(yōu)選的實(shí)施方式是：所述青綠賴桿物料是長(zhǎng)度為2 + 0. 2cm的青綠玉米賴桿。
[0023] 本發(fā)明公開(kāi)了一株產(chǎn)阿魏酸醋酶的隧淀粉乳桿菌，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述隧淀粉乳桿菌 (Lactobacillus amylovo;rus)cCGMCCNo.11056 可[^水解淀粉，并可W產(chǎn)生阿魏酸醋酶， 預(yù)示該菌株在造紙、紡織、食品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)有潛在的應(yīng)用價(jià)值，特別是其發(fā)酵青膽飼 料可W提高乳酸含量8%，降低抑值0. 27,縮短發(fā)酵周期15天，在制備發(fā)酵青膽飼料和其 它微生態(tài)制劑中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 本發(fā)明所述隧淀粉乳桿菌（Xactobacillusamylovorus)C菌株已于2015年7月 6日保藏于"中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)）"，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 11056。
[00巧]圖 1 :隧淀粉乳桿菌(Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 水解淀粉產(chǎn) 生透明圈。
[0026] 圖 2 :隧淀粉乳桿菌(Xactobacillusamylovorus)CCGMCCNo. 11056 水解阿魏酸 乙醋產(chǎn)生透明圈。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1 :隧淀粉乳桿菌化actobacillus amylovorus) C菌株的篩選及生理生化 特性鑒定
[0028] 將山東青膽發(fā)酵玉米飼料樣品用無(wú)菌水洗涂并適度稀釋后涂布在MRS培養(yǎng)基瓊 脂平板上，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，挑取白色圓形且過(guò)氧化氨酶陰性的菌落，鏡檢為長(zhǎng)桿菌，反復(fù) 劃線確定純菌落，接種到MRS培養(yǎng)基，顯微觀察個(gè)體形態(tài)及進(jìn)行生化反應(yīng)測(cè)定，最終篩選得 到一株隧淀粉乳桿菌，該菌株命名為隧淀粉乳桿菌化actobacillusamylovorus)C。
[0029] 上述隧淀粉