一種適于pk-15細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種適于PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清無(wú)蛋白培 養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] PK-15系豬腎細(xì)胞（PigKi化ey)，體外培養(yǎng)呈上皮樣貼壁細(xì)胞，該細(xì)胞對(duì)多種病毒 比較敏感，如豬圓環(huán)病毒（PCV)、豬攝病毒（CSFV)、豬細(xì)小病毒（PPV)等，可應(yīng)用于豬圓環(huán)病 毒疫苗、豬攝病毒疫苗、豬細(xì)小病毒疫苗等的制備。
[0003] 豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV)在分類(lèi)上屬圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬。 PCV不凝集牛、羊、豬、雞等多種動(dòng)物和人的紅細(xì)胞，其抗血清不能抑制豬細(xì)小病毒（PPV) 對(duì)紅細(xì)胞的凝集性。在臨床上主要表現(xiàn)為斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥（Postweaning MultisystemicWastingSyn化ome，PMW巧和豬皮炎與腎炎綜合征（PDN巧。除PMWS外， PDNS(豬皮炎與腎病綜合征）、PNP(增生性壞死性肺炎）、PRDC(豬呼吸道疾病綜合征）、繁 殖障礙、先天性顫抖、腸炎等相關(guān)的豬病，死亡率10%~30%不等，較嚴(yán)重的豬場(chǎng)在暴發(fā)本 病時(shí)死淘率高達(dá)40%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。眾所周知，疫苗免疫是防控豬圓環(huán)病 毒病的主要手段。
[0004] 豬攝（classicalSWinefever,CS巧是由豬攝病毒（CSFV)引起的一種高度接觸 性熱性傳染病，具有很強(qiáng)的傳染性，不同年齡、性別和品種的豬均能感染，而且高致死率，它 的傳播必然會(huì)對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失，1984年世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（01巧將其列入A類(lèi) 傳染病，目前我國(guó)也將其定為一類(lèi)傳染病。豬攝除可引起敗血癥W外，還會(huì)引起一系列其它 臨床表現(xiàn)，如妊娠母豬流產(chǎn)、胎兒崎變、慢性營(yíng)養(yǎng)性消耗、淋己細(xì)胞和血小板減少等。目前， 世界大部分國(guó)家都采取了嚴(yán)格的衛(wèi)生防疫措施、剔除豬攝感染豬、凈化豬群來(lái)控制和消滅 豬攝。一些發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)防疫和防控手段已經(jīng)根除了豬攝，但我國(guó)尚未徹底消滅，所W接種 豬攝疫苗尤其重要，也是控制豬攝傳播的重要手段之一。
[000引 目前對(duì)于PK-15細(xì)胞的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式是貼壁培養(yǎng)，通常在生長(zhǎng)及維持培養(yǎng)基中需 要加入10% -20%的動(dòng)物血清，W提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分及細(xì)胞保持正常形態(tài)的支 持蛋白。該傳統(tǒng)工藝效率低、生產(chǎn)成本高；不同血清批次間差異顯著；放大重現(xiàn)性較差；對(duì) 下游純化工藝要求高；容易出現(xiàn)血清出復(fù)雜成分導(dǎo)致的疫苗質(zhì)量隱患，設(shè)及生物安全和公 共衛(wèi)生問(wèn)題。另外，目前全球血清供應(yīng)趨緊，運(yùn)大大影響了疫苗企業(yè)的生產(chǎn)效率。因此盡量 少用血清已成為PK-15細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展趨勢(shì)，同時(shí)低血清與無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究與 應(yīng)用已被列入十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)常通過(guò)添加牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膜島素、重組表皮生長(zhǎng)因子等動(dòng)物 源成分W及大豆水解蛋白等植物源蛋白成份，從而來(lái)降低血清的使用量。但是上述蛋白質(zhì) 對(duì)生物制品（如疫苗）的安全性有很大影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明主要提供了一種適于PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基及其制備方 法，具有無(wú)蛋白、無(wú)動(dòng)物源成份、化學(xué)成份明確幾大優(yōu)點(diǎn)，在科研上可減少血清對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程 和結(jié)果的干擾，使用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，使PK-15細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中是在2%低血清濃度 條件下進(jìn)行，減少了血清的用量。其技術(shù)方案如下：一種適于PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清無(wú)蛋 白培養(yǎng)基，其包括W下組分：
[0008] 氨基酸部分包括W下組分：
[0009] 心天冬氨酸^lSmgZL 以精氨酸鹽酸鹽50-100mg/L
[0010] L-天冬酷胺：1-15成g/L 心半脫氨酸鹽酸鹽10-20mg/L 心巧気酸20-50mg/L 心?、^挺漸胺500-1000mgZL 以甘氨酸5-40mg/L 以組氨酸鹽酸鹽20-50mg/L 心巧巧/安;酸50-150mg/L心巧績(jī)峻50-150mg/L L-蛋氨酸20-50mg/L 心賴(lài)氨酸鹽酸鹽100-200mg/L 以苯丙氨酸沸-lOQmg/L 以脯氨酸10-50mg化 心絲妓酸10-50mg/L 心蘇氨酸40-K)0mg/L 以色氨酸5-20mg/LL-酪氨酸20-90mg/L L-娜訪酸 3.0-100mg/L ^內(nèi)試酸 1-15mg/L 心婷脯氨酸^lOmgZL 以脫氨酸鹽酸鹽50-100mg化，
[0011] 維生素部分包括W下組分：
[0012] 丙麵酸鋼50-150mg/L生物素0.001-0.01mg/L 煙酷胺1-10從g壓 硫辛酸0.0001-O.Olmg/L 腐胺 0.001-0,1 ;mg/L 鹽酸化唉醇 0.001-0.1.rog/L D-泛酸巧 1 -10mg/L 核巧索O.! -1mg/L 氯化膽堿^lOmgZL 鹽酸硫胺1-10mg/L 葉騰 1-10mg/Li-肌醇 10-20mg/L VBll0.001-1mg/L,
[0013] 無(wú)機(jī)鹽部分包括W下組分：
[0014] A：水氣化巧 50-200mgZL 氣化鐘 200-500mg/L 硝酸鐘0.01-1mg/L 無(wú)水硫酸鏡10-100mg/L 無(wú)水磯酸氨二鋼0.]-]0mg/L 無(wú)水憐酸二氨納100-200mg/L 氯化銷(xiāo)撕蜘-70蜘nig/L 六水氯化儀1 (W㈱mg/L,
[0015] 微量元素部分包括W下組分：
[0016] 八gNO, 化00001-0.0001mg/L 八ICl.; ? 6H:0 0.000] -0.001mg/L Ba(C2l-I:;〇2)2 0.001-0.01mg/L CdSO..; ?8H2O 0.001-0.01mg/L CoCb?6打込O 0.001-0.0!mg/L 打(S〇4)3? ] 5H?_0 化0001 -0.001mg/L CuS〇4?SH.O0.0001-0.001mg/L Fe(NO：〇3? 9HjO 0.00!-().0!mg/L FeS〇4?-HoO 0.001-0.01mg/L GeO] 沿JQ飢-食，㈱Img/L H2SeO.; 0.001-0.0img/L KBi 0.00001-0.0001mg/L KI 0.00001-0.0001mg/L MnCI, ?4H2O 0.0001-0.001mg/L NaF 0.00 !-0.01mglL NajSiO:; ?9H2O 0.01-0.1mg/L NaV〇3 0.0001-0.001mg/L (NH4)6M07024 ?4H2O 0.001-0.01mg/L NiS〇4* 6H.0 化0001-0.001mg/L RbCl 0.000!-0.001ms/L ZnS〇4? 7中0 0.00i-0.01mg/L ZrOCh?8H2O0.001-化01mg/L
[0017] 如樹(shù)2 。淚(MBl-O扇Olmg/L TiCL 化00的-化㈱Img/L Na?.SeO,，，5H:0 ".00 ] -0.01mg/L，
[0018] 還包括W下其他組分：
[0019] 胸昔 mg/L 次黃嚷吟 0 01-1mg/L 亞油酸 0.01-1mg/LD-葡萄糖 3000-5000mg/L 齡紅 1 -20mg化 HEPES1000-4000mg/L〇
[0020] 優(yōu)選的，一種適于PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基的組分如下：氨基酸部 分包括W下組分：
[0021] 以天冬氨酸Mmg/L 以精氨酸鹽酸鹽85mg/L L-天冬醜胺13.5mg/LL-半脫氨酸鹽酸鹽15.56rag/L心谷氨酸38.5mg/L 心谷氨醜胺舞4mg/L 心甘氨酸35mg/L 以組氨酸鹽酸鹽47mg/L 心開(kāi)巧結(jié)酸105〇13化 心巧結(jié)酸105mg/L 以蛋氨酸39mg/L 以賴(lài)氨酸鹽酸鹽156mg/L 心苯丙氨酸66mg/LL-脯氨酸25mg/L 心絲氨酸42.5mg/L 以蘇氨酸％.5mg/L 以色氨酸化mg/L 心酪氨酸71.45mg/L L-鄉(xiāng)氨酸 90.5mg/LL-丙氨酸乂45mg/L 以婷脯氨酸10mg/L 心脫氨酸鹽酸益77.62mg化，
[0022] 維生素部分包括W下組分：
[0023] 丙麵酸鑰UOmgZL 生物素0.0085mg/L 煙醜胺4.5mg/L 硫辛酸0.0005mg/L
[0024] 腐胺 0.006mg/L 鹽酸ft唆醇 0.006mg/L D-泛酸鶴4Jini/L 核黃素〇.565mg/L 氯化膽堿6.8m:g:/L 鹽酸硫胺4.17mg/L 葉酸5.65mg/L i-肌醇]0.6mg/LVB12 化0065mg/L，
[00巧]無(wú)機(jī)鹽部分包括W下組分：
[0026] 巧水氯化巧1始.5mg/L 氯化鐘3謙名mg/L 硝酸鐘0.038mg/L 無(wú)水硫酸鏡97.67mg/L 無(wú)水憐酸氨二鑰0.41mg/L 無(wú)水憐酸二氨鋼108.5mg/L 氯化納5452.5mg/L 六水氯化鎊21.5mg化，
[0027] 微量元素部分包括W下組分：
[0028] AgNO'; 0.000065rag/L AlCh? 6H.0 化000964mg/L Ba(QHjC):); 化00462mg/L CdS〇4? 8巿〇 0.0029mg/L C0CI2? 5H,P化00383mg化 Cr(S〇4)3? 15H,0 0.00061mg/L CuSO,?5H.0 化00072mg/L Fe(NC);;):; ?州2〇 化004832mgZL FeSOi? 7H:0 0.0044mg/L 鞠從 化㈱的5ffig化 報(bào)誕〇3 0.()055mg/'L KBr 0.000066mg/L
[0029] 魁 化麵脫5孤g/L MnCb* 4山〇 0.00064mg/L NaF 0.0(3507mg/L Na]SiO; * 9H]0 0.064mg/L NaVO:; 0.00076mg/L (NH4、，M化〇24?4H20 0.0056mg/L NiS〇4?食祀O 0.000284mg/L RbCl 0.00036mg/L ZnS〇4? 7H游 0.0043mg/L ZrOC!：. ?8H2O (U)055mg/L SnCU 0.000064mg/L TiCU 0.00077mg/L NcbSeO.i?SH.O 化00865mg/L，
[0030] 還包括W下其他組分：
[0031] 胸昔0.0635rag化 次黃嘿吟0.042rag化 亞油酸 0.042mg/LD-葡萄糖 4500mg/L 齡紅i5mg/LHE化S2979mg/L。
[0032] -種適于PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：
[0033]