重組腺病毒疫苗株高適應(yīng)性hek293克隆細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及克隆細(xì)胞株，尤其設(shè)及肥K293克隆細(xì)胞株，本發(fā)明還設(shè)及所述肥K293 克隆細(xì)胞株在培養(yǎng)重組腺病毒rAdV-SFV-E2株中的應(yīng)用，屬于肥K293細(xì)胞的克隆和應(yīng)用領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬攝（Classicalswinefever,CS巧是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一，被世界 動(dòng)物衛(wèi)生組織（01巧列為OIE動(dòng)物疫病名錄，中國將其列為一類傳染病。自20世紀(jì)50年 代末推廣使用豬攝兔化弱毒疫苗W來，有效地控制了CSF在中國大面積爆發(fā)和流行。但近 幾年，中國豬攝的發(fā)病率又呈上升趨勢，其流行特點(diǎn)也發(fā)生了重大改變，W溫和型豬攝和母 豬持續(xù)感染所引起的流產(chǎn)、死胎和新生仔豬死亡等為主，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 豬攝兔化弱毒疫苗存在一些不足，給該病的凈化及根除帶來了許多困難。首先，現(xiàn)行豬攝弱 毒疫苗的生產(chǎn)工藝存在較多問題，用于生產(chǎn)疫苗的轄牛睪丸細(xì)胞和轄牛血清經(jīng)常污染BVDV 或其抗體，嚴(yán)重影響豬攝疫苗的效價(jià)和質(zhì)量；其次，弱毒疫苗接種時(shí)受豬攝母源抗體干擾， 如果免疫程序不當(dāng)，容易造成免疫失敗、先天性感染、隱性感染或免疫耐受。因此，研究一種 安全有效的新型豬攝疫苗是當(dāng)務(wù)之急。
[0003] W活病毒為載體的疫苗，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對目的抗原的免疫應(yīng)答，是一種極具 開發(fā)前景的新型疫苗。重組腺病毒可模仿病毒天然的感染方式，并直接在體內(nèi)表達(dá)天然的、 具有生物活性的抗原蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。近年 來，W重組腺病毒作為載體攜帶外源基因的新型疫苗研究越來越受到人們的關(guān)注。由本發(fā) 明人所在團(tuán)隊(duì)研制的腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬攝基因工程疫苗rAdV-SFV-E2株， 結(jié)合了腺病毒載體高效遞送和甲病毒復(fù)制子載體高效表達(dá)外源基因的功能。該疫苗株高度 安全，且免疫效力與豬攝兔化弱毒疫苗C株相當(dāng)，并克服了C株疫苗的一些缺陷，如生產(chǎn)工 藝、母源抗體干擾、不同疫苗免疫時(shí)相互干擾等。
[0004] 由于復(fù)制缺陷型重組腺病毒的增殖需要在可反式提供缺失蛋白的肥K293細(xì)胞進(jìn) 行包裝，依靠細(xì)胞的生長增殖病毒。
[0005] 因此，從肥K293母本細(xì)胞株中篩選獲得重組腺病毒rAdV-SFV-E2株高適應(yīng)性的 肥K293克隆細(xì)胞株，對豬攝基因工程疫苗開發(fā)和生產(chǎn)均具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是從肥K293母本細(xì)胞株中克隆得到能夠高效培養(yǎng)重 組腺病毒rAdV-SFV-E2株并顯著提高病毒滴度的肥K293克隆細(xì)胞株。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0008]本發(fā)明選擇種細(xì)胞肥K293,采用有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆，然后選取單個(gè)克 隆進(jìn)一步亞克隆，經(jīng)2次亞克隆，最終獲得4株單克隆細(xì)胞株，分別命名為肥K293-D9、 肥K293-B8、肥K293-D10 和肥K293-C4。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步對肥K293克隆細(xì)胞株肥K293-D9、肥K293-B8、肥K293-D10和 肥K293-C4的形態(tài)和生長特性進(jìn)一步研究，并分析其對重組腺病毒rAdV-SFV-E2株的適應(yīng) 性。
[0010] 生長特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單細(xì)胞克隆株肥K293-D9和肥K293-B8的生長速度明顯 快于其它兩株細(xì)胞及母本細(xì)胞。
[0011] 用重組腺病毒rAdV-SFV-E2株感染單克隆細(xì)胞株4化后的病毒滴度測定發(fā)現(xiàn)，單 克隆細(xì)胞株肥K293-D9和肥K293-B8的病毒滴度分別為l(f2和10 8'5TCID5e/mU顯著高出 肥K293-D10和肥K293-C4的病毒滴度。
[0012] 單克隆細(xì)胞對重組腺病毒rAdV-SFV-E2株的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單克隆細(xì)胞株 肥K293-D9和肥K293-B8的適應(yīng)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于肥K293-D10和肥K293-C4。
[0013] 綜上所述，單克隆細(xì)胞株肥K293-D9和肥K293-B8在生長速度、病毒的適應(yīng)性及 穩(wěn)定性等各方面的性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其它的肥K293單克隆細(xì)胞株；因此，本發(fā)明將兩株性能優(yōu) 異的、重組腺病毒rAdV-SFV-E2株高適應(yīng)性的克隆細(xì)胞株肥K293-D9及肥K293-B8提交至 專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏；其中，肥K293單克隆細(xì)胞株肥K293-D9的微生物保藏編號為： CGMCCNo. 11097 ;分類命名是：人胚胎腎細(xì)胞肥K293 ;保藏時(shí)間是：2015年8月12日；保藏 單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、；保藏地址是：北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0014] 肥K293單克隆細(xì)胞株肥K293-B8的微生物保藏編號為：CGMCCNo. 11096;分類命 名是：人胚胎腎細(xì)胞肥K293;保藏時(shí)間是：2015年8月12日；保藏單位是：中國微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、；保藏地址是：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科 學(xué)院微生物研究所。
[0015] 本發(fā)明所提供的兩株性能優(yōu)異的、重組腺病毒rAdV-SFV-E2株高適應(yīng)性的肥K293 克隆細(xì)胞株肥K293-D9和肥K293-B8能夠高效增殖病毒，顯著提高病毒滴度，在重組腺病毒 rAdV-SFV-E2株的生產(chǎn)中應(yīng)用潛力尤為巨大。
[0016] 由此，本發(fā)明公開了所述應(yīng)用所述肥K293克隆細(xì)胞株肥K293-D9和肥K293-B8在 培養(yǎng)病毒中的應(yīng)用，包括W下步驟：
[0017] (1)培養(yǎng)權(quán)利要求1或2所述的肥K293克隆細(xì)胞株至單細(xì)胞層；（2)接種病毒株 進(jìn)行培養(yǎng)；（3)收獲病毒液。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步考察了應(yīng)用肥K293克隆細(xì)胞株肥K293-D9培養(yǎng)重組腺病毒疫苗株 的各項(xiàng)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病毒接種劑量、收獲病毒液的時(shí)間W及病毒株的吸附時(shí)間等 參數(shù)對于病毒液的效價(jià)均能產(chǎn)生顯著的影響。
[0019] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在接種病毒rAdV-SFV-E2株時(shí)，按照接種劑量MOI= 0. 1加入病毒， 能獲得較高效價(jià)的病毒液，其效價(jià)最高達(dá)到108'5±°'2TCID日。/mL;按照接種劑量MOI= 0. 1加 入病毒時(shí)，在病毒感染后24~3化收獲病毒液，其效價(jià)達(dá)到最高~1〇s'4±°'2TCIDw/ mL)，其中，在病毒感染后3化收獲病毒液，其效價(jià)達(dá)到最高（l(f4±°'2TCIDw/mL)，超過3化收 獲病毒液，效價(jià)呈急驟下降態(tài)勢。
[0020] 按照MOI= 0. 1接種病毒，吸附0. 5-比后補(bǔ)加病毒維持液，能夠明顯提升病毒滴 度，其中，吸附Ih后再補(bǔ)加病毒維持液，病毒效價(jià)達(dá)到最高（l〇s'6±°'2TCIDw/mL);為了有效 提升病毒液的滴度，本發(fā)明優(yōu)選在接種病毒后吸附Ih后補(bǔ)加病毒維持液，再繼續(xù)進(jìn)行培 養(yǎng)。
[0021] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，無血清的病毒維持液與含1%牛血清的病毒維持液無顯 著差異，考慮成本，因此本發(fā)明優(yōu)選采用無血清的病毒維持液。
[0022] 所述的病毒包括腺病毒（Adenovirus)或慢病毒化entivirus);優(yōu)選的，所述腺病 毒包括重組腺病毒或其他血清型腺病毒；所述重組腺病毒為重組5型人腺病毒；所述病毒 株為重組腺病毒株，優(yōu)選為重組腺病毒rAdV-SFV-E2株。
[0023] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下有益效果：
[0024] 本發(fā)明從肥K293母本細(xì)胞株中克隆得到了 2株性能優(yōu)異的肥K293克隆細(xì)胞株 肥K293-D9和肥K293-B8,重組腺病毒rAdV-SFV-E2株在兩株細(xì)胞克隆株中能夠高效增殖， 并獲得較高效價(jià)的病毒液，其毒價(jià)不低于l〇8'°TCIDw/mU與肥K293母本細(xì)胞培養(yǎng)的病毒相 比，病毒滴度提高了 10倍左右，在豬攝基因工程疫苗的生產(chǎn)中有較高的應(yīng)用價(jià)值。
[00巧]本發(fā)巧所徙及到的術(shù)語定女
[0026] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0027] 術(shù)語"單細(xì)胞克隆"意指將一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之不斷分裂，形成一個(gè)細(xì)胞群的 過程，運(yùn)一群細(xì)胞來源于一個(gè)共同的祖先細(xì)胞。
[0028] 術(shù)語"亞克隆"意指在細(xì)胞克隆中，對培養(yǎng)的細(xì)胞，從原有的克隆中再篩選出具有 某種特性的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
[0029] 術(shù)語"傳代"意指當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營 養(yǎng)液的過程，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存。
【附圖說明】
[0030] 圖1四株單克隆細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)：其中，A:肥K293-D10 ;B出EK293-C4;C: 肥K293-D9;D:肥K293-B8 ;
[0031] 圖2肥K293單克隆細(xì)胞株的生長曲線測定結(jié)果；
[0032] 圖3單克隆細(xì)胞對重組腺病毒rAdV-SFV-E2株的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（*p<0. 05)。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但運(yùn)些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0035] 毒株：重組腺病毒載體豬攝基因工程疫苗rAdV-SFV-E2株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈 爾濱獸醫(yī)研究所豬烈性傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)構(gòu)建、鑒定和保存。肥K293細(xì)胞購于美國菌種保藏 中屯、（ATCC)。
[0036] 實(shí)施例1肥K293克隆細(xì)胞株的克隆及鑒定
[0037] 1實(shí)驗(yàn)方法
[0038] 1. 1肥K293克隆細(xì)胞株的克隆
[0039] (I)選擇種細(xì)胞肥K293;
[0040] 似細(xì)胞傳代：首先復(fù)蘇步驟（1)所選擇的種細(xì)胞到T25(Corning)的細(xì)胞瓶中， 培養(yǎng)3化左右，按照1:4的比例進(jìn)行傳代，克隆前連續(xù)傳代10次；
[0041] (3)采用有限稀釋法在96孔板內(nèi)進(jìn)行肥K293單細(xì)胞克隆，消化后的肥K293細(xì)胞 計(jì)數(shù)后稀釋到1個(gè)細(xì)胞/mU將稀釋好的細(xì)胞鋪于96孔板，0.ImL/孔，37°C5%C〇2培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)，觀察10日；
[0042] (4)選取單個(gè)克隆進(jìn)一步亞克隆，經(jīng)2次亞克隆，選取單克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培 養(yǎng)液為DMEM(含10%FB巧，并對克隆細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。
[0043]