一種檢測抗除草劑草甘膦蛋白的單克隆抗體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種雜交瘤細(xì)胞株、一種單克隆抗體 及其在檢測抗除草劑草甘麟蛋白中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 20世紀(jì)80年代W來，轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物得到了大面積的推廣與種植，開創(chuàng)了抗 除草劑作物發(fā)展的新局面。由于草甘麟除草劑具有廣譜、無±壤殘留及環(huán)境友好的特性，草 甘麟陸續(xù)在100多個(gè)國家注冊，其用量與日俱增，成為世界上應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品 種，其年銷售值一直居農(nóng)藥之首，全世界年銷售值超過了 29. 3億美元。但它作為一種非選 擇性除草劑，對(duì)農(nóng)作物同樣有滅生性作用，運(yùn)極大限制了草甘麟在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。 美國孟山督公司通過向植物轉(zhuǎn)入具草甘麟抗性的CP4-EPSPS基因，成功培育出了商業(yè)化的 轉(zhuǎn)基因抗草甘麟作物，大大減少了田間雜草使用草甘麟的用量及除草費(fèi)用，為草甘麟的應(yīng) 用發(fā)展開辟了新的途徑。目前已取得了一系列抗草甘麟作物，它們是：大豆、棉花、玉米、油 菜、甜菜、煙草、花生、小麥、向日葵、馬鈴馨、水稻、番茄、首猜、百脈根、黑麥草、楊樹等，具有 我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高抗草甘麟的5 -締醇丙酬酸莽草酸一3 -憐酸合成酶巧-enolpyru vylshikimate-3-phosphatesynthase,EPSP巧的轉(zhuǎn)基因油菜、玉米、小麥和棉花已進(jìn)入中 間實(shí)驗(yàn)階段。隨著轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)和商品化的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物釋放可能帶來的環(huán)境 安全問題引起了人們的高度重視。因此，建立和完善轉(zhuǎn)基因成分的檢測技術(shù)，尤其是我國比 較缺乏的轉(zhuǎn)基因作物蛋白檢測技術(shù)，既是轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)價(jià)的重要研究內(nèi)容，也是基因工 程安全管理的重要技術(shù)保障；為促進(jìn)我國轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供有力的技術(shù)支撐，保 護(hù)我國人民健康，保護(hù)廣大農(nóng)民的利益和我國農(nóng)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。
[0003]G2-EPSPS蛋白編碼基因克隆自草甘麟污染±壤細(xì)菌基因組文庫，具有很高的草 甘麟耐受性。該基因編碼的蛋白經(jīng)分析屬于ClassI類型，酶活測定顯示該蛋白具有高底 物親和能力和低草甘麟親和力，因此能賦予宿主高草甘麟除草劑耐受力。在酶學(xué)水平上 G2-EPSPS基因草甘麟耐受性高于孟山都公司的CP4-EPSPS基因。
[0004]在轉(zhuǎn)基因植物的研制開發(fā)或在對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行篩選或安全性評(píng)價(jià)時(shí)，往往需要 對(duì)轉(zhuǎn)入的外源性基因進(jìn)行定性或半定量測定。運(yùn)些定性或半定量測定的關(guān)鍵在于單克隆抗 體的使用，但是，目前已有的抗G2-EPSPS蛋白的單克隆抗體難W達(dá)到較高的敏感度和特異 性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種較高的敏感度和特異性的抗G2-EPSPS蛋白的單克隆抗 體。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，一種雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為 CGMCCNO. 10497。
[0007]再一方面，本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10497的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
[0008] 再一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的單克隆抗體轉(zhuǎn)G2-EPSPS基因農(nóng)作物中的 用途。
[0009] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠通過肥STERN化OT方法對(duì)G2-EPSPS蛋白進(jìn)行檢 ，并對(duì)CP4-EPSPS蛋白不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，并且對(duì)5種不同來源的各種非G2-EPSPS轉(zhuǎn)基因 作物也不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)。
[0010] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予W詳細(xì)說明。
[0011] 生物材料保藏
[0012] 本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編號(hào)為 CGMCCNO. 10497,保藏日期為2015年04月10日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中屯、，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究 所，分類命名為抗G2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
【附圖說明】
[0013] 附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0014] 圖1是實(shí)施例2中單克隆抗體親和層析純化的結(jié)果圖。
[0015] 圖2是實(shí)施例2中單克隆抗體2KG3低倍稀釋應(yīng)用在WesternBlot檢測里的結(jié)果 圖。
[0016] 圖3是實(shí)施例2中單克隆抗體2KG3高倍稀釋應(yīng)用在WesternBlot檢測里的結(jié)果 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]W下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0018] 一方面，一種雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCCNO. 10497。
[0019] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10497的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
[0020] 其中，由保藏編號(hào)為CGMCCNO. 10497的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生單克隆抗體的方法可W 為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如小鼠腹水法。
[0021] 再一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的單克隆抗體轉(zhuǎn)G2-EPSPS基因農(nóng)作物中的 用途。
[0022] 其中，可W使用本領(lǐng)域常規(guī)的蛋白免疫檢測方法將如上所述的單克隆抗體用于檢 測轉(zhuǎn)G2-EPSPS基因農(nóng)作物。例如，可W從待檢測的農(nóng)作物中提取全蛋白，然后用免疫雜交 (WESTERNBLOT)的方法進(jìn)行檢測，如果出現(xiàn)G2-EPSPS的陽性條帶，則指示待檢測的農(nóng)作物 為轉(zhuǎn)G2-EPSPS基因農(nóng)作物。
[0023]W下，通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。W下實(shí)施例中，所用的試劑均為商購獲 得。
[0024] 實(shí)施例1
[00巧]對(duì)取自草甘麟污染±壤樣品提取細(xì)菌總DM,經(jīng)電泳檢測后來自2號(hào)樣品（G2)的 總DNA質(zhì)量較好。對(duì)G2細(xì)菌總DNA進(jìn)行部分酶切（Sau3AI)，回收3-20化大小片段，同時(shí) 對(duì)PACYC184質(zhì)粒進(jìn)行BamHI酶切，然后進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化aroA基因缺失大 腸桿菌ER2799,在M9培養(yǎng)基上篩選生長菌落。從生長菌落中提取質(zhì)粒后進(jìn)行測序鑒定，將 含有EPSPS編碼基因aroA的質(zhì)粒命名為pACe2g"^A。根據(jù)NCBIblast分析結(jié)果，找到一個(gè)長 1332bp編碼444個(gè)氨基酸的aroA基因，根據(jù)G2-aroA(即G2-EPSP巧序列設(shè)計(jì)引物，在上游 引物5'端人工添加BamHI酶切序列，在下游引物5'端人工添加HindIII酶切序列。引物 合成、測序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。具體所用引物序列如表1所示。
[0026] 表1
[0027]
[002引按照表2和表3所列的條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0029]表 2
[0030]
[00引]表3
[0032]
[003引按照表4所列的條件進(jìn)行PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿 -tt： 園O
[0034] 表 4
[0035]
[0036] 其中，連接和轉(zhuǎn)化的條件包括：4°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌巧.COli) JM109的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在加有Amp(50mg/血），IPTG(200mg/mL)和X-gal(20mg/mL)的 LB平板上進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化的白色菌落篩選。質(zhì)粒提取及酶切鑒定后送于諾賽生物公司測序鑒 定。
[0037] 按照表5和表6所列的條件，將測序檢測正確插入目的片段基因序列的重組質(zhì)粒 利用BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶消化，連接到相應(yīng)內(nèi)切酶消化的表達(dá)載體祀T28a上， 構(gòu)建成重組表達(dá)載體。
[0038] 表 5
[0039]
[0040] 表 6
[0041]
[004引經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化的重組質(zhì)粒和載體片段利用QXIIDNA純化回收試劑盒(QIAEXIIDNAGelExtractionKit)經(jīng)過凝膠電泳進(jìn)行目的片段回收，回收方法包括：（1) 將目的條帶從0. 5 %的瓊脂糖凝膠上切下，稱量其重量；（2)加入3倍體積的QXIBuffer 和2倍體積的滅菌的超純水和5y1的QXII懸浮液；（3) 50°C水浴lOmin，直至膠全部溶解； (4)W最大速度離屯、0. 5min，棄上清；（5)沉淀重懸于500yL的QXIBuffer,W最大速度離 屯、0. 5min，棄上清；（6)沉淀重懸于500JiL的陽Buffer,W最大速度離屯、0. 5min，棄上清； (7)沉淀干燥后加入30yL的(1地20 ; (8) 50°C水浴