Ac016745.3作為前列腺癌分子靶標(biāo)及其在診斷試劑盒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種前列腺癌分子祀標(biāo)AC016745. 3及其在 診斷試劑盒中的應(yīng)用，包括通過該生物分子祀標(biāo)在前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的 診斷、前列腺癌治療及狀況的監(jiān)測、前列腺癌指導(dǎo)用藥的監(jiān)測及前列腺癌預(yù)后檢測等領(lǐng)域 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)《ASC0年度報(bào)告：2015臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展》中相關(guān)內(nèi)容，液體活檢技術(shù)被 列為腫瘤治療領(lǐng)域下一個(gè)十年趨勢之一。血液中的一些分子標(biāo)志物已經(jīng)被應(yīng)用于一些 疾病的診斷，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶用于肝炎的診斷，白細(xì)胞數(shù)目用于判斷炎癥。血液循環(huán)腫瘤 DNA(circulatingtumorDNA，CtDNA)是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外游離DNA，存在于血液、滑膜 液和腦脊液等體液中，體細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細(xì)胞調(diào)亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，其主要是 由短的單鏈或雙鏈DNAW及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，WDNA蛋白質(zhì)復(fù)合物或游離DNA 兩種形式存在。CtDNA來自腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變，因此，CtDNA是一種特征性的新的腫瘤 生物標(biāo)記物，并且還可W被定性、定量和追蹤，將成為臨床腫瘤的早期診斷、預(yù)后判定及跟 蹤隨訪等提供一系列方便、快捷、特異、無創(chuàng)或微創(chuàng)和分子生物學(xué)檢測手段，尤其對于一些 不具有典型臨床癥狀、檢查無特異性和診斷困難的腫瘤可避免復(fù)雜的、具有創(chuàng)傷性的活檢。 結(jié)合新一代測序技術(shù)（NG巧將變成"液體活檢"，并替代侵入組織性活檢。
[0003] AC016745. 3 屬于IncRNA(Ion即on-codingRNA，長鏈非編碼RNA)，是一類轉(zhuǎn)錄本 長度超過200個(gè)核巧酸的非編碼RNA，近年研究發(fā)現(xiàn)它是一類具有重要生物學(xué)功能的RNA, 參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào) 控過程，在細(xì)胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要的 調(diào)控作用。近年來，越來越多的權(quán)威研究證實(shí)IncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或促進(jìn) 腫瘤的作用，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)亡、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面，均具有十分重要 作用。目前己有較多IncRNAs被證實(shí)在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、膀脫 癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達(dá)并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。早期有效檢測腫瘤的發(fā) 生、發(fā)展及提高抗癌藥物的療效對于癌癥的治療尤為重要，發(fā)明新型腫瘤標(biāo)志物作為診斷 與治療的祀點(diǎn)一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。
[0004] 前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在 男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為第一位危害 男性健康的腫瘤。亞洲前列腺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美國家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢，且增 長比歐美發(fā)達(dá)國家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲W后發(fā)病，95%發(fā) 生于60歲W上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥 狀，即使有所不適，也不足W引起病人的重視，當(dāng)腫瘤增大壓迫尿道時(shí)，又往往與前列腺增 生相混淆。在我國約80%的病人首先發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時(shí)，病變已達(dá) 晚期，預(yù)后不良。 陽0化]前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有直腸指檢、血清前列腺特異性抗原（PSA)檢 、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。直腸指檢是最簡單、最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法，主要通過 醫(yī)生的食指觸摸前列腺，用W發(fā)現(xiàn)很多無癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根 治的機(jī)會(huì)。但W上的方法都存在局限性。例如直腸指檢的局限性主要在4個(gè)方面：（1)患者 前列腺腫塊不大時(shí)，易漏診；（2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期，不易根治； (3)患者直腸有疾患時(shí)不能使用此檢測；（4)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)可能有漏診或者誤診的可能。 正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml),當(dāng)處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病 狀態(tài)時(shí)，PSA升高成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標(biāo)，但其也存在一定局限性：（1)需要 取血檢測，對患者有一定的損傷；（2)PSA增高也常見與非前列腺癌疾病，如前列腺炎癥、前 列腺肥大等，因此不易確診；（3)PSA增高確診前列腺癌時(shí)，往往患者已經(jīng)屬于中后期，達(dá)不 到早期診斷的目的。前列腺超聲波檢測操作簡單直觀、無損傷，通過顯示腫塊的大小、數(shù)目、 位置、密度、邊緣、形體、有無巧化及巧化的形態(tài)、大小、數(shù)目、分布W及周圍的暈環(huán)、皮膚改 變等提供定位及定性征象并判斷病變的性質(zhì)；其局限性是：（1)對致密性的小癌灶容易漏 診；（2)有時(shí)候不能提供明確的定性診斷；（3)因其不能顯示腫瘤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及周圍組織所 W診斷符合率很低；（4)對一些缺乏典型征象的實(shí)性良惡性腫塊有較高的誤診率。活組織 病理檢查因其創(chuàng)傷性、復(fù)雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，一般與 其他方法技術(shù)連用。
[0006] 近年來的研究表明，IncRNA與前列腺癌密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展 和轉(zhuǎn)移，所W對腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、個(gè)體化治療、轉(zhuǎn)移的檢測和預(yù)后等可能有相應(yīng) 的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種與前列腺癌相關(guān)的新的前列腺癌分子祀標(biāo)，W及前列 腺癌診斷試劑盒，W及該前列腺癌分子祀標(biāo)和前列腺癌診斷試劑盒在前列腺癌高危人群篩 選、診斷、治療及狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)AC016745. 3在前列腺癌組織樣本中的含量比前列腺正常組織 樣本中的含量高，顯示AC016745. 3與前列腺癌的腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在著密切的相關(guān)性。因 此，本發(fā)明提出AC016745. 3作為與前列腺癌相關(guān)的新的前列腺癌分子祀標(biāo)，并提供含有該 前列腺癌分子祀標(biāo)AC016745. 3 (作為標(biāo)志物）的診斷試劑盒，W及該分子祀標(biāo)或診斷試劑 盒在前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療及狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的前列腺癌分子祀標(biāo)AC016745. 3,是一種IncRNA，全長508bp，其核巧 酸序列為SEQIDNO. 1所示。
[0010] 前述的前列腺癌分子祀標(biāo)AC016745. 3,可用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療前列腺 癌的藥物。其抑制劑AC016745. 3SiRNA(SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7)可用于制備預(yù)防、緩 解和/或治療前列腺癌的藥物。
[0011] 本發(fā)明還提供含有前述前列腺癌分子祀標(biāo)AC016745. 3的診斷試劑盒。該診斷試 劑盒可用于前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測等。
[0012] 前述的前列腺癌分子祀標(biāo)AC016745. 3作為標(biāo)志物在制備前列腺癌高危人群篩 選、診斷、治療狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測的試劑盒中的應(yīng)用，是通過檢測被試者組織樣本、血液和 尿液中的AC016745. 3的含量，并與正常水平AC016745. 3含量相比較，W進(jìn)行前列腺癌高危 人群篩選、診斷、治療狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測。
[0013] 前述的前列腺癌分子祀標(biāo)AC016745. 3作為標(biāo)志物在制備前列腺癌高危人群篩 選、診斷、藥物設(shè)計(jì)、治療及狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測的試劑盒中及藥物中的應(yīng)用，可把被試者血 清、尿液和組織樣本中AC016745. 3的含量通過總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、定量PCR進(jìn)行檢測。
[0014] 前述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒包括： (1) 組織樣本、血液和尿液中總RNA提取試劑； 每50mg組織或200ul血液或200ul尿液，使用：
(2) 反轉(zhuǎn)錄試劑；
(3) 定量PCR試劑；
引物包括AC016745. 3和對照0 -ACTIN兩對引物； (4) 前列腺正常組織CDNA 作為陰性對照與檢測樣本CDNA共同定量PCR檢測，每個(gè)反應(yīng)體系使用與檢測樣本CDNA相同量。
[0015] 前述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒結(jié)果分析檢測樣本和陰性對照間比較采用t 檢驗(yàn)，P<0. 05為差異顯著，判為標(biāo)本檢測陽性。
[0016] 前述檢測試劑盒所用對照為0 -ACTIN，其引物序列如下： 0-ACTIN上游引物序列：5 ' -CCTCTCCCAAGTCCACACAG-3 '(沈QIDNO. 2) 0-ACTIN下游引物序列：5 ' -GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 '(沈QIDNO. 3)。
[0017] 前述檢測試劑盒所檢測AC016745. 3,其引物序列如下： AC016745. 3 上游引物序列：5 ' -GGTGACGAAAATTCTACATTGCT-3 '(沈QIDNO. 4)AC016745. 3 下游引物序列：5 ' -ACCTGGCTGGTGTCCTCTG-3 '(沈QIDNO. 5)。
[0018] 本發(fā)明為前列腺癌的診斷和治療提供了一種新的分子祀標(biāo)AC016745. 3。該分子 祀標(biāo)的抑制劑可用于制備治療前列腺癌的藥物，同時(shí)可作為標(biāo)志物應(yīng)用于制備診斷試劑盒 中。使用該分子祀標(biāo)及含有該分子祀標(biāo)的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡單、取材方便、 安全無創(chuàng)傷，且具有較高的特異性、靈敏性和方便大量篩查的特點(diǎn)。該分子祀標(biāo)適合應(yīng)用于 前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑒定、前列腺癌治療及狀況的監(jiān)測、前列腺癌指導(dǎo)用 藥的監(jiān)測和前列腺癌預(yù)后監(jiān)測等領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0019] 圖1.AC016745. 3在前列腺癌組織樣本中和正常組織樣本中的含量檢測。
[0020] 圖2.前列腺癌PC-3細(xì)胞系中AC016745. 3siRNA對AC016745. 3沉默效率。
[0021] 圖3. AC016745. 3-siRNA顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。 陽02引圖4.藥物SB20580顯著抑制前列腺癌細(xì)胞系中ACO16745. 3的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但下述實(shí)施 例僅用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍，下面實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，按照 常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0024] 實(shí)施例1:AC016745. 3在前列腺癌組織樣本中和正常組織樣本中的含量檢測 本實(shí)施例主要步驟如下： 1、組織樣本中總RNA的提取 獲得前列腺癌根治術(shù)患者手術(shù)后的組織樣本，同時(shí)獲得淋己結(jié)清掃術(shù)的患者切除的組 織樣本作為對照。提取前述組織樣本的總RNA于無DNA和無RNA酶污染的1. 5毫升離屯、管 中。
[00巧]組織樣本中提取總RNA的試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。提取的總RNA通過使用化ermNanoDrop2000c分光光度計(jì)，測定260/280nm紫外波長的比值進(jìn)行的濃 度測定。 陽0%] 2、定量檢測組織樣本中的IncRNA (O反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA單鏈 按照下表1配置反轉(zhuǎn)錄體系，配置過程在冰上進(jìn)行。配置好的體系在PCR儀上進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為38攝氏度15分鐘，85攝氏度5秒。 W別表1
表1中X表示加入的RNA體