大豆抗花葉病毒基因GmNN1及其功能標(biāo)記的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種大豆抗花葉病毒基因GmNNl及其 功能標(biāo)記的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆是我國重要糧食和油料作物，含有多種生理活性物質(zhì)，具有廣泛工業(yè)用途，在 國民經(jīng)濟(jì)中占有不可替代的重要地位。大豆還是人類食物結(jié)構(gòu)中主要植物蛋白來源，是當(dāng) 今市場上重要保健食品和優(yōu)質(zhì)蛋白飼料。近年來，世界對(duì)大豆需求量逐年上升，而我國大豆 消費(fèi)量的=分之二依賴進(jìn)口。因此，提高大豆產(chǎn)量成為我國乃至世界大豆育種的重要任務(wù) 和研究方向。
[0003] 大豆花葉病毒（soybeanmosaicvirus,SMV)病是一種全球性大豆病害，嚴(yán)重影 響大豆產(chǎn)量和品質(zhì)。我國W黃淮流域、漢江平原和華北地區(qū)發(fā)病較重，東北地區(qū)每年也有發(fā) 生。大豆受花葉病毒侵染后，植株矮化、葉片皺縮、葉面積減小、光合能力下降，營養(yǎng)生長受 阻，生長速率下降，根瘤重下降，單株芙數(shù)、單株粒數(shù)減少，粒重降低，褐斑粒率上升，品質(zhì)下 降。據(jù)統(tǒng)計(jì)，該病害引起的大豆產(chǎn)量損失一般在5%~7%，重病年損失可達(dá)10%~20%， 個(gè)別年份或少數(shù)地區(qū)產(chǎn)量損失可高達(dá)50%，甚至造成絕收。
[0004] 對(duì)于大豆花葉病毒病，生產(chǎn)上目前還沒有十分有效的化學(xué)藥物進(jìn)行防治，而培育 和種植抗病品種是防治該病發(fā)生的最經(jīng)濟(jì)有效方法。因此，通過生物技術(shù)手段，克隆并轉(zhuǎn)化 功能基因，創(chuàng)制抗病毒轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)，培育抗花葉病毒新品種就成為減輕病毒危害，提高大 豆產(chǎn)量的重要途徑。
[0005] 近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展W及重要農(nóng)作物病害基因的克隆與應(yīng)用，研 究者逐漸認(rèn)識(shí)到利用生物技術(shù)手段進(jìn)行抗病基因克隆與轉(zhuǎn)化的重要性，而利用寄主抗性來 克隆抗病相關(guān)基因就成為運(yùn)一領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。
[0006] 在植物抗病毒基因研究方面，煙草中的N基因是第一個(gè)被分離的抗病毒基 因，該基因起源于煙草野生種Nicotianaglutinosa，編碼一種胞質(zhì)內(nèi)定位蛋白，具有 TIR-NBS-LRR結(jié)構(gòu)。N基因介導(dǎo)的抗煙草花葉病毒燈MV)有兩個(gè)顯著特點(diǎn)=(I)TMV侵染后 大約4化發(fā)生過敏反應(yīng)化ypersensitiveresponse,HR)，即在侵染點(diǎn)部位產(chǎn)生枯斑，病毒 被限制在枯斑或其鄰近部位；(2)具有溫度敏感性，當(dāng)攜帶N基因的煙草接種病毒后，28°C W下培養(yǎng)，發(fā)生HR,抗TMV功能正常，而較高溫度時(shí)，TMV能夠在攜帶N基因的煙草植株內(nèi)擴(kuò) 散，如果將已經(jīng)擴(kuò)散的煙草移到低于28°C條件下培養(yǎng)，則發(fā)生系統(tǒng)性皿。N基因是一個(gè)單顯 性基因，可抗絕大多數(shù)煙草花葉病毒組成員，在番茄、煙草中均已獲得轉(zhuǎn)N基因的抗TMV植 株。
[0007] 據(jù)研究，煙草N基因與花葉病毒TMV間的相互作用是基因?qū)蚣僬f的經(jīng)典模型。 研究發(fā)現(xiàn)，存在于TMV復(fù)制酶簇基端的SOkDa解旋酶基序的氨基酸序列（p50序列）能夠在 含有N基因的煙草中引發(fā)過敏反應(yīng)，是N基因?qū)?yīng)的無毒基因，通過將運(yùn)段p50序列轉(zhuǎn)化到 感病的煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株，被稱為轉(zhuǎn)基因P50植株。將純合的轉(zhuǎn)基因P50植株 與純合的轉(zhuǎn)N基因煙草栽培種進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)雜交種中同時(shí)含有N基因及其無毒基因P50。 當(dāng)種子萌發(fā)1-2個(gè)星期發(fā)現(xiàn)，運(yùn)些Fi煙草幼苗發(fā)生了系統(tǒng)性過敏反應(yīng)而最終死亡，只有在N 基因或p50發(fā)生突變而失去功能的情況下，雜交種幼苗才能夠存活下來。進(jìn)一步研究還發(fā) 現(xiàn)，轉(zhuǎn)有N基因的煙草植株能夠介導(dǎo)對(duì)煙草花葉病毒除化生理小種W外其它所有類型生理 小種的抗性反應(yīng)，在病毒侵染部位出現(xiàn)壞死斑，發(fā)生過敏反應(yīng)，限制TMV的傳播，并對(duì)TMV或 其它病原類似物的再次入侵產(chǎn)生廣譜抗性。
[0008] 在大豆抗病毒基因研究中，國內(nèi)外已命名或報(bào)道的大豆抗SMV基因主要有Rsvl、 Rsv3、Rsv4、Ra、Rc、Rg和化，其中Rsvl與化Vl連鎖遺傳，Ra、Rc、Rg與化連鎖遺傳，Rsvl 定位在大豆F連鎖群，Rsv3定位在B2連鎖群，Rsv4定位在mb連鎖群。陳受宜等通過文 庫篩選和5'RACE-PCR，從大豆抗花葉病毒品種科豐1號(hào)中獲得3個(gè)抗病相關(guān)基因KRUKR3 和KR4。其中KRl蛋白具有Toll/白細(xì)胞介素-1受體燈IR)、NBS和不完整的LRR等抗病基 因分子特征，RT-PCR分析表明，KRl受外源水楊酸和大豆花葉病毒株系Sa誘導(dǎo)；KR3長度為 2353bp，編碼636個(gè)氨基酸，KR3蛋白在結(jié)構(gòu)上與煙草花葉病毒N基因蛋白有較高同源性，具 有Toll/白細(xì)胞介素-1受體燈IR)、NBS等抗病基因分子特征，Southern雜交顯示KR3在 基因組中為低拷貝，RT-PCR分析表明，該基因表達(dá)受外源水楊酸誘導(dǎo)；KR4長度為3818bp， 編碼1211個(gè)氨基酸，KR4蛋白也具有NBS等抗病基因分子特征，Southern雜交顯示KR4在 基因組中為低拷貝，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因表達(dá)受外源水楊酸和大豆花葉病毒株系N3誘 導(dǎo)。
[0009] 基因功能標(biāo)記與基因控制的性狀緊密聯(lián)系，通過其檢測的序列多態(tài)性與表型直接 相關(guān)，且與性狀完全共分離。因此，該類標(biāo)記如用于分子標(biāo)記輔助育種準(zhǔn)確性更高?；蚬?能標(biāo)記開發(fā)基于功能明確的基因W及該基因在品種間的等位變異。目前，基因功能標(biāo)記開 發(fā)已在小麥、水稻等作物深入研究。何屯、堯等克隆了普通小麥2A和2D染色體上PPO基因 Ppo-Al與巧O-Dl全長序列，針對(duì)巧O-Dl位點(diǎn)等位變異巧O-Dla和巧O-D化分別開發(fā)了顯 性標(biāo)記PP016和PP029,PP016在低PPO活性品種擴(kuò)增713bp條帶，而PP029在高PPO活性 品種擴(kuò)增490bp條帶，且與PPO活性相關(guān)?；痳等克隆了不同抗性水稻中Xa3,序列比對(duì)發(fā) 現(xiàn)，序列間存在多態(tài)性，根據(jù)其多態(tài)性開發(fā)了顯性功能標(biāo)記BB3-RF/BB3-RR，該標(biāo)記僅在抗 病品系中擴(kuò)增出255bp條帶。大豆基因功能標(biāo)記開發(fā)鮮有報(bào)道，Juwattanasomran等根據(jù) 控制大豆芳香氣味GmBADH2等位變異，開發(fā)了SNP標(biāo)記，該標(biāo)記能夠區(qū)分芳香氣味品種和無 芳香氣味品種，同時(shí)該標(biāo)記已用于分子標(biāo)記輔助育種培育芳香氣味大豆品種。然而至今，尚 無大豆抗花葉病毒功能標(biāo)記的研究報(bào)道。
[0010] 因此，利用現(xiàn)代基因克隆技術(shù)，進(jìn)一步篩選或發(fā)掘更多抗病基因，驗(yàn)證基因功能， 開發(fā)功能標(biāo)記，為大豆抗病育種提供有效的功能基因和分子標(biāo)記輔助選擇工具，仍是今后 一段時(shí)期重要課題與研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種大豆抗花葉病毒基因GmNNl及其功能標(biāo)記的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明提供的大豆抗花葉病毒基因GmNNl,其核巧酸序列如SEQIDNo.1所示。
[0013] 本發(fā)明提供的大豆抗花葉病毒基因GmNNl的感病等位基因，其核巧酸序列如SEQ IDNo. 2 所示。
[0014] 本發(fā)明提供大豆抗花葉病毒基因GmNNl編碼的蛋白質(zhì)，其為：
[001引1)由SEQIDNo. 3所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或
[0016] 2)在SEQIDNo. 3所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且 具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0017] 本發(fā)明提供大豆抗花葉病毒基因GmNNl的感病等位基因編碼的蛋白質(zhì)，其為：
[001引1)由SEQIDNo. 4所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或
[0019] 2)在SEQIDNo. 4所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且 具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0020] 本發(fā)明提供了含有本發(fā)明所述大豆抗花葉病毒基因GmNNl的表達(dá)載體。
[0021] 本發(fā)明提供了含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[002引本發(fā)明還提供了大豆抗花葉病毒基因Gm順1的GmNNl-AC功能標(biāo)記，該標(biāo)記是由W下引物對(duì)擴(kuò)增得到，所述引物對(duì)的核巧酸序列為：
[0023] AC-F:CTTTCGGAGGCGATTGATCA(如沈QIDNO. 5 所示）
[0024] AC-R:CCACAATCTTCTCAATCAACTCG(如沈QIDNO. 6 所示）。
[0025] 大豆抗花葉病毒基因GmNNl的GmNNl-AC功能標(biāo)記的應(yīng)用方法，通過下述引物對(duì)擴(kuò) 增待檢大豆基因組DNA，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物：
[0026] 所述引物對(duì)的核巧酸序列為：
[0027] AC-F:CTTTCGGAGGCGATTGATCA(如沈QIDNO. 5 所示）
[0028] AC-R:CCACAATCTTCTCAATCAACTCG(如沈QIDNO. 6 所示）；
[0029] 如果用上述引物對(duì)能夠擴(kuò)增出34化P的片段，則標(biāo)志著該待檢大豆抗大豆花葉病 毒病。
[0030] 本發(fā)明還提供了大豆抗花葉病毒基因GmNNl的GmNNl-GT功能標(biāo)記，該標(biāo)記是由W 下引物對(duì)擴(kuò)增得到，所述引物對(duì)的核巧酸序列為：
[0031] GT-F:GGGCTTTCGGAGGCGATTGATCG(如沈QIDNO. 7 所示）
[0032] GT-R:GGGGCGCAAGTCATCTAGCTCTCA(如沈QIDNO. 8 所示）。
[0033] 大豆抗花葉病毒基因GmNNl的GmNNl-GT功能標(biāo)記的應(yīng)用方法，通過下述引物對(duì)擴(kuò) 增待檢大豆基因組DNA，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物：
[0034] 所述引物對(duì)的核巧酸序列為：
[0035] GT-F:GGGCTTTCGGAGGCGATTGATCG(如沈QIDNO. 7 所示）
[0036] GT-R:GGGGCGCAAGTCATCTAGCTCTCA(如沈QIDNO. 8 所示）；
[0037] 如果用上述引物對(duì)能夠擴(kuò)增出749bp片段，則標(biāo)志著該待檢大豆感大豆花葉病毒 病。
[0038] 綜合應(yīng)用GmNNl-AC、GmNNl-GT標(biāo)記，可鑒定大豆品種對(duì)SMV的抗感性。
[0039] 本發(fā)明提供了大豆抗花葉病毒基因GmNNl在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0040] 申請(qǐng)人依據(jù)煙草抗花葉病毒N基因序列，克隆大豆中的同源基因GmNNl,分析基 因在不同大丑抗、感品種間的表達(dá)差異，闡明基因是否參與大丑抗SMV反應(yīng)；構(gòu)建GmNNl原 核表達(dá)載體、進(jìn)行基因原核表達(dá)；構(gòu)建GmNNl基因的超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大豆，獲得轉(zhuǎn)基因陽 性植株，探究基因在大豆中的抗花葉病毒功能；分析基因在不同大豆抗、感品種間的序列差 異，并依據(jù)序列差異開發(fā)功能標(biāo)記，同時(shí)利用SMV抗感RIL群體及不同抗感SMV大豆品種驗(yàn) 證標(biāo)記可靠性和實(shí)用性。研究結(jié)果可為大豆抗SMV育種提供功能基因與選擇標(biāo)記。
【附圖說明】
[0041] 圖1是實(shí)施例5中4個(gè)大豆品種的RT-PCR擴(kuò)增電泳照片（M:DNAMarkerDL2 000 ; I:冀豆12號(hào)；2 :五星2號(hào)；3 :冀NF58 ;4 :南農(nóng)1138-2。
[004引圖2是實(shí)施例5中菌液PCR檢測pGM-Gm順1陽性克隆的電泳照片（M:DNAMarker DL2 000 ;1-17 :pGM-Gm順 1 陽性克?。?。
[0043] 圖3是實(shí)施例6中GmNNl在冀豆12號(hào)和冀NF58接種葉片中的差異表達(dá)柱形圖。
[0044] 圖4是實(shí)施例6中大豆抗、感SMV品種中GmNNl及其編碼蛋白序列差異對(duì)比圖（A: GmNNl基因序列差異，差異位點(diǎn)為2(K)bp、91化P;B=GmNNl基因編碼蛋白序列差異，差異位點(diǎn) 為67aa、304aa;冀豆12號(hào)、五星2號(hào)為抗病品種，冀NF58、南農(nóng)1138-2為感病品種）。
[004引圖5是實(shí)施例7中Gm