一種高效篩查g蛋白-偶聯(lián)受體表達(dá)的融合基因構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子影像學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體包括一種新型G蛋白-偶聯(lián)受體， GProtein-CoupledRec巧tor(GPCR)的融合基因的構(gòu)建，在運(yùn)種融合基因表達(dá)條件下有利 于提高GPCR的產(chǎn)量和快速的篩查鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] GPCR是一類有屯次跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白，也是最大的膜蛋白和細(xì)胞表面受體家族。 GPCR在真核生物細(xì)胞中廣泛分布，從酵母菌到人類細(xì)胞中都有發(fā)現(xiàn)，人體中有超過800種 GPCR，響應(yīng)范圍包括：光、離子、氣味分子、荷爾蒙、神經(jīng)遞質(zhì)素和多膚等。GPCR幾乎參與了 人體的各種生理調(diào)節(jié)作用，其突變會(huì)造成各種疾病的發(fā)生，長(zhǎng)期W來一直是生命科學(xué)和藥 物研發(fā)的熱口領(lǐng)域和前沿方向。目前有大約一半的現(xiàn)代藥物都是WGPCR為祀點(diǎn)，但是四分 之一GPCR的配體都不明確，許多功能還不清楚，大量的蛋白結(jié)構(gòu)尚未解析。截至2015年， PDB數(shù)據(jù)庫僅有25個(gè)GPCR結(jié)構(gòu)，僅占GPCR總數(shù)的3%化ttp://甜Cr.scripps.edu/)，運(yùn) 嚴(yán)重制約了GPCR功能的深入研究W及基于作用機(jī)制的藥物研發(fā)。
[0003] 盡管GPCR結(jié)構(gòu)的研究對(duì)于藥物研發(fā)十分重要，但是除了最先得到高分辨率蛋白 結(jié)構(gòu)的視紫紅質(zhì)巧hodopsin)W外的GPCR的表達(dá)量都很低，是深入研究的一大阻力。例如， CX3CRKchemokinereceptor1)和ADRB3(0 3-A化energicReceptor)均為目前沒有結(jié)構(gòu) 的GPCR，但是它們分別在艾滋病、冠狀動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和慢性阻塞性肺炎、肥胖癥、 II型糖尿病等的致病過程中起著關(guān)鍵作用，結(jié)構(gòu)信息的缺失導(dǎo)致了功能研究和藥物開發(fā)的 困難。
[0004]GPCR的低表達(dá)量是限制結(jié)構(gòu)功能研究的主要因素，目前廣泛應(yīng)用的異源GPCR表 達(dá)體系主要有：大腸桿菌表達(dá)體系、酵母細(xì)胞表達(dá)體系、昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞 表達(dá)體系W及無細(xì)胞表達(dá)體系等幾種。表1歸納了各種表達(dá)體系的主要優(yōu)缺點(diǎn)，可W看出 表達(dá)體系的選擇對(duì)GPCR結(jié)構(gòu)-功能研究及對(duì)應(yīng)藥物的開發(fā)至關(guān)重要。目前，用于生物技 術(shù)領(lǐng)域及藥物研發(fā)的表達(dá)體系主要有原核和真核表達(dá)系統(tǒng)兩種。大腸桿菌表達(dá)體系為原 核表達(dá)系統(tǒng)中最為廣泛使用的體系，已經(jīng)成功地表達(dá)出了多種GPCR，且具有表達(dá)水平高、操 作簡(jiǎn)單、周期短、易于大規(guī)模高密度培養(yǎng)及成本低等優(yōu)點(diǎn)，但其致命的弱點(diǎn)是無法實(shí)現(xiàn)GPCR 翻譯后的修飾，嚴(yán)重影響著GPCR生物活性的體現(xiàn)。鑒于W上原因，利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) GPCR受到了越來越廣泛的重視，而哺乳動(dòng)物表達(dá)體系是目前真核表達(dá)系統(tǒng)中最能完備地制 備出折疊正確并具備完全生物活性的GPCR表達(dá)體系。哺乳動(dòng)物表達(dá)體系的優(yōu)勢(shì)在于，它具 有正確的翻譯后修飾功能（包含二硫鍵的正確形成、糖基化、憐酸化、寡聚體的實(shí)現(xiàn)等）W 及擁有最接近真核動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境和細(xì)胞膜憐脂組成，并且該體系下活性GPCR蛋 白的比例較高。但是，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系由于其表達(dá)過程的復(fù)雜性和條件的多樣性，使 得培養(yǎng)難度加大、要求更高。
[0005] 盡管多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的建立為天然環(huán)境下膜蛋白的表達(dá)純化提供了 一定的平臺(tái)，但并不是所有的GPCR都能順利表達(dá)，對(duì)原有的基因進(jìn)行有效的改造是最好 的提高蛋白表達(dá)產(chǎn)量的方法，包括添加基因表達(dá)操縱序列，或者添加蛋白穩(wěn)定序列等方法。 此外，蛋白表達(dá)與否，蛋白表達(dá)量的鑒定也需要建立行之有效，方便快捷的方法。Western Blot檢測(cè)是最常用的蛋白表達(dá)檢測(cè)方法，但要經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、收獲，蛋白提取、電泳，轉(zhuǎn)膜， 封閉，一抗二抗解育，顯色等復(fù)雜的操作步驟，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、不穩(wěn)定因素多，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出 錯(cuò)都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗，并且由于需要特異性的抗體，成本較高。此外，因?yàn)楹芏郍PCR缺乏 特異性的單克隆抗體或抗體的特異性不高，所W依賴于抗體檢測(cè)的Western Blot不具有通 用性。因此傳統(tǒng)的表達(dá)檢測(cè)方法不能滿足GPCR表達(dá)的快速檢測(cè)的要求，給蛋白的進(jìn)一步研 究造成了不便。
[0006] 基于W上背景，本發(fā)明WCX3CR1和ADRB3為例，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系T-REX293 中，提供一種新型的融合基因構(gòu)建方法，不僅有利于提高蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，提高功能性分 子的比例；還能夠?qū)Φ鞍妆磉_(dá)產(chǎn)量，W及蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布、聚集狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)和優(yōu)化； 此外還可W為穩(wěn)株的篩選提供一種簡(jiǎn)便有效的方式。WCX3CR1/ADRB3為例，即通過構(gòu)建 化o33-CX3CRl/ADRB3-eGFP融合蛋白表達(dá)檢測(cè)系統(tǒng)，利用化Odopsin在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系 中穩(wěn)定的特點(diǎn)提高目的GPCR插膜效率，提高表達(dá)量。并且利用eGFP的綠色巧光特性可W探 測(cè)目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，蛋白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用和與其他蛋白的結(jié)合W及 蛋白在細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)。還可W利用巧光進(jìn)行穩(wěn)株篩選，方便快捷。另外，在GPCR基因的起始 和末尾分別添加相應(yīng)的蛋白酶切位點(diǎn)，與純化過程中可W將融合蛋白切除，只留下GPCR運(yùn) 樣也可W消除融合蛋白對(duì)GPCR結(jié)構(gòu)功能上的影響。運(yùn)種融合基因構(gòu)建方式不僅能夠提高 蛋白產(chǎn)量，降低消耗；還方便快捷，快速鑒定蛋白是否適合我們的表達(dá)體系使用，將為GPCR 結(jié)構(gòu)功能研究中蛋白表達(dá)鑒定提供一個(gè)行之有效的平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于GPCR的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)研究目前仍停留在實(shí)驗(yàn)室逐一攻破的水平上，缺 乏對(duì)已知GPCR表達(dá)水平的高通量篩查手段。為此，本發(fā)明的目的是建立一種適用于肥K293 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的能做到GPCR高效表達(dá)，快速檢測(cè)的基因構(gòu)建新方法。本發(fā)明的特點(diǎn)是 在獨(dú)特的基因構(gòu)建方式下，能夠有效的提高GPCR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中產(chǎn)量，提高功能性分 子的比例同時(shí)可W完成GPCR表達(dá)情況的快速篩選及表達(dá)條件優(yōu)化，為GPCR的結(jié)構(gòu)功能的 研究奠定基礎(chǔ)，為基于結(jié)構(gòu)的藥物開發(fā)提供平臺(tái)。
[0008] 本發(fā)明的目的是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種篩查G蛋白-偶聯(lián)受體GPCR表達(dá)的融合基因構(gòu)建方法，即在G蛋白-偶聯(lián)受 體GPCR的前段插入人視紫紅質(zhì)化odopsin起始端的33個(gè)殘基W及相應(yīng)的蛋白酶切位點(diǎn)， 在GPCR的末端插入化S巧個(gè)殘基）或者1D4巧個(gè)殘基）抗原表位、相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，W及 綠色巧光蛋白eGFP，構(gòu)建Mio33-p;rotease-GPCR-lD4-p;rotease-eGFP。
[0010] 對(duì)于低GC含量（含量《60% )的GPCR用重疊延伸PCR方式構(gòu)建，具體包括W下 步驟：
[0011] 1).利用PCR構(gòu)建化o33-protease-GPCR-lD4-protease-eGFP的S個(gè)片段：先 分別PCR得到片段 1 :Mio33-p;rotease、片段 2 :p;rotease-GPCR-lD4-p;rotease和片段 3 : protease-eGFP，電泳并膠回收S個(gè)片段；
[0012] 2).利用重疊延伸PCR將S個(gè)片段連接在一起組成目的片段，即化o33-protease- GPCR-lD4-protease-eGFP;
[0013] 3)?目的片段Rho33-protease-GPCR-lD4-protease-eGFP的前后兩段分別具有 HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)，通過雙酶切W及T4連接酶構(gòu)建到表達(dá)載體PCDNA4上，轉(zhuǎn)化入 ToplO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行性測(cè)序驗(yàn)證；
[0014] 4).基因測(cè)序正確后，將質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)進(jìn)入肥K293細(xì)胞，通過巧光觀察即可快速鑒定 GPCR是否能夠表達(dá)；
[0015] 對(duì)于高GC含量（含量> 60% )的GPCR用一步基因克隆法方式構(gòu)建，具體包括W 下步驟：
[0016] 1).利用PCR構(gòu)建Mio33-p;rotease-GPCR-lD4-p;rotease-eGFP的前兩個(gè)片段：先 分別PCR得到片段 1 :Mio33-p;rotease和片段 2 :p;rotease-GPCR-lD4-p;rotease，電泳并膠 回收兩個(gè)片段；
[0017] 2).利用重疊延伸PCR將兩個(gè)片段連接在一起組成目的片段，即得到目的基因的 前半段Mi〇33-p;rotease-GPCR-lD4-p;rotease片段；
[001引3).將載體質(zhì)粒PCDNA3. 1-eGFP用HindIII和KasI雙酶切處理，得到線性化載體PCDNA3. 1-eGFP，將重疊延伸得到的PCR片段與線性化載體片段按照等比例混合，利用一步 法基因克隆試劑盒（購自諾贊唯公司）將PCR片段插入載體上；產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化Topl