紅色納米硒的生物制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種納米砸的制備方法，特別是一種紅色納米砸的生物制備方法。 技術(shù)背景：
[0002] 砸是一種對(duì)人體具有重要生物學(xué)效應(yīng)的微量元素。砸W砸代半脫氨酸的形式存在 于多種砸蛋白中，砸不僅參與白內(nèi)障、克山病和大骨節(jié)病等地方性疾病的生理、病理過(guò)程， 還與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。
[0003] 人體對(duì)不同砸源的吸收和利用效率差別很大。無(wú)機(jī)砸源吸收快，半數(shù)至死量低，安 全范圍窄；有機(jī)砸源相對(duì)安全但吸收緩慢，機(jī)體利用率低；一般的單質(zhì)砸不能被生命體吸 收。紅色納米砸是一種特殊的單質(zhì)砸，有研究表明，納米砸吸收快、半衰期長(zhǎng)、使用安全。因 此納米砸兼有無(wú)機(jī)砸和有機(jī)砸的優(yōu)點(diǎn)，是預(yù)防和治療砸缺乏疾病的理想砸源。
[0004] 人們?cè)谘芯可飳?duì)砸鹽和蹄鹽的降解作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可W還原某些砸化合物而 出現(xiàn)紅色，而某些蹄化合物被還原則產(chǎn)生深灰色物質(zhì)。到2002年，已經(jīng)有很多有關(guān)細(xì)菌、 真菌和酵母還原無(wú)機(jī)態(tài)砸的文獻(xiàn)報(bào)道。比如自養(yǎng)的紅核紅螺菌巧hodospirillum rubrum) 在缺氧并且向光生長(zhǎng)的條件下，可W將亞砸酸鋼為還原單質(zhì)砸。Simona報(bào)道了在黃巧屬 豆類根系統(tǒng)中獲得了一種菌株，能將四價(jià)的砸還原為零價(jià)的砸，在液體培養(yǎng)基中，砸濃度為 0. 5mmol/L的亞砸酸鋼在52h內(nèi)被完全還原為單質(zhì)砸；當(dāng)再次添加亞砸酸鋼到運(yùn)一培養(yǎng)基 內(nèi)，濃度為2. Ommol/L的亞砸酸鋼在12化后，經(jīng)測(cè)定有87%的亞砸酸鋼被還原；TEM和邸X 分析結(jié)果表明，該菌的胞外和胞內(nèi)均出現(xiàn)顆粒狀的單質(zhì)砸。 陽(yáng)0化]當(dāng)前有關(guān)微生物還原砸化物的報(bào)道多數(shù)還停留在實(shí)驗(yàn)研究上，在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用 中普遍采用化學(xué)法制備納米砸?；瘜W(xué)法制備納米砸時(shí)，還原劑和砸存在當(dāng)量關(guān)系，工藝復(fù) 雜，成本較高。
[0006] 我們發(fā)現(xiàn)小球藻能將無(wú)機(jī)態(tài)的砸（如亞砸酸鋼等）轉(zhuǎn)化為紅色單質(zhì)砸，而采用小 球藻還原無(wú)機(jī)態(tài)砸即制備納米砸，特別是紅色納米砸或納米砸還未見(jiàn)報(bào)道。利用小球藻 煙ilorella pyrenoidosa)作為制備納米砸的生物材料，不僅能夠降低納米砸的生產(chǎn)成本， 還為蛋白核小球藻開(kāi)辟了新的藥用和保健價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明就是要提供一種紅色納米砸的生物制備方法，其針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，采 用W小球藻為培養(yǎng)材料，將其培養(yǎng)在含砸鹽的BG-Il培養(yǎng)基中，在一定的光溫條件下進(jìn)行 紅色納米砸的制備，不僅能夠降低納米砸的生產(chǎn)成本，還為蛋白核小球藻開(kāi)辟了新的藥用 價(jià)值和保健用途；且在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)環(huán)境友好，不會(huì)造成環(huán)境污染。
[0008] 本發(fā)明提供一種紅色納米砸的生物制備方法，W小球藻為生物材料，W含砸無(wú)機(jī) 鹽為砸的來(lái)源，其包括將小球藻接種于含砸鹽的培養(yǎng)基中，在光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，控制培 養(yǎng)溫度為22-28 °C，制備紅色納米砸。
[0009] 本發(fā)明所述的一種紅色納米砸的生物制備方法，其是將小球藻接種于含砸鹽的培 養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)基中的砸濃度為80-120mg/l，含小球藻的培養(yǎng)液的抑為6-7. 2,蛋白核小 球藻液濃度Aess為0. 8-3. 0。
[0010] 本發(fā)明所述的一種紅色納米砸的生物制備方法，優(yōu)選是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)渡到穩(wěn) 定期生長(zhǎng)期（即對(duì)數(shù)-穩(wěn)定期）的小球藻藻細(xì)胞；將處于對(duì)數(shù)-穩(wěn)定期的小球藻液，接種于 含亞砸酸鋼的培養(yǎng)基中，控制所述對(duì)數(shù)-穩(wěn)定期的小球藻液的濃度Aess值在2. 2-2. 6,培養(yǎng) 基中砸的濃度為90-1lOmg/l，培養(yǎng)基中小球藻液的抑為6. 7-7. 1，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控 制培養(yǎng)時(shí)溫度為23-27°C，培養(yǎng)時(shí)間2-23天，控制光照強(qiáng)度為0-7200LX，并在培養(yǎng)時(shí)每日搖 動(dòng)若干次。
[0011] 本發(fā)明所述小球藻為蛋白核小球藻，所述蛋白核小球藻為完整細(xì)胞和/或破碎細(xì) 胞，優(yōu)選是完整細(xì)胞的蛋白核小球藻。
[0012] 本發(fā)明所述光照條件是控制光照強(qiáng)度為1440-60(K)Lx;優(yōu)選光照條件是光照強(qiáng)度 為 4320LX。
[0013] 本發(fā)明提供一種紅色納米砸的制備方法，W小球藻為生物材料，培養(yǎng)在含砸鹽的 培養(yǎng)基中在光照存在的條件下進(jìn)行納米砸的制備，不僅能夠降低納米砸的生產(chǎn)成本，還為 蛋白核小球藻開(kāi)辟了新的藥用和保健價(jià)值；且在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)環(huán)境友好，不會(huì)造成環(huán)境污 染。生產(chǎn)制造成本低，在最適培養(yǎng)條件下生成紅色納米砸的砸元素的轉(zhuǎn)化率平均達(dá)到68% W上，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單。
【附圖說(shuō)明】：
[0014] 圖1，利用本發(fā)明方法制備的比例尺為SOOnm時(shí)蛋白核小球藻液中的單質(zhì)砸； 陽(yáng)01引圖2,為比例尺為1ym時(shí)蛋白核小球藻液中的單質(zhì)砸。
【具體實(shí)施方式】：
[0016] 通過(guò)下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，其將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明技 術(shù)方案，但不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0017] 實(shí)施例：本發(fā)明實(shí)施例中所述各材料均可通過(guò)市售方法獲得；
[0018] 本發(fā)明所用材料與方法：
[0019] 本發(fā)明所用藻種為蛋白核小球藻購(gòu)于中科院水生生物研究所，編號(hào)為FACHB-9 ;
[0020] 所用器材：高速冷凍離屯、機(jī)、pH計(jì)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、生物潔凈工作臺(tái)、高壓 滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱、透射電子顯微鏡均為市售實(shí)驗(yàn)室常用儀器；
[0021] 使用原料：亞砸酸鋼、鋼酸鋼、濃硫酸、高氯酸、濃鹽酸、抗壞血酸、漠化氨、苯酪、 DAB(3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺）、甲苯等均使用分析純； 陽(yáng)02引實(shí)驗(yàn)用原料配置：2. 19mg/mL的亞砸酸鋼溶液即每Iml溶液含有Selmg,其配置方 法是準(zhǔn)確稱量2. 19g亞砸酸鋼溶于200ml去離子水后定容至IL;其他濃度的亞砸酸鋼溶液 通過(guò)按比例稀釋IgSe/L的亞砸酸鋼溶液獲得；還可采用現(xiàn)有方法進(jìn)行配置； 陽(yáng)02引消化液：稱量IOg鋼酸鋼，溶于150ml濃硫酸，待溶液冷卻至室溫后，加入200ml高 氯酸后定容至IL;
[0024] 皿r-Br2溶液：30mlBr2溶于100mL皿r，避光儲(chǔ)存； 陽(yáng)0巧]5%苯酪溶液：稱量5g苯酪，在60°C水浴中溶于100mL去離子水，避光儲(chǔ)存； 陽(yáng)0%]DAB-HCl溶液：準(zhǔn)確稱量0. 3gDAB，溶于IOml去離子水后，加入2ml濃度為IM的 肥1，現(xiàn)配現(xiàn)用并在避光處放置。
[0027] 本發(fā)明實(shí)施方式中的樣品預(yù)處理采用下述方法：為了測(cè)定單質(zhì)砸的含量，首先測(cè) 量單質(zhì)砸和有機(jī)砸的總含量，樣品處理方法是取小球藻液于4000巧m離屯、5min，棄去上清 液，取沉淀；再測(cè)量有機(jī)砸的含量，樣品處理方法是取小球藻液在4000巧m離屯、5min，棄去 上清液，加蒸饋水后反復(fù)凍融S次，再W4000rpm離屯、5min，棄沉淀，取上清；最后是測(cè)量未 轉(zhuǎn)化的殘留砸，樣品處理方法是取小球藻液在4000rpm離屯、5min，棄去沉淀，取上清。
[0028] 將W上沉淀或上清分別轉(zhuǎn)移到50ml圓底燒瓶中，加入適量消化液（每2g濕小球 藻對(duì)應(yīng)IOml消化液）和沸石，在電爐上加熱5min至溶液清亮后，關(guān)閉電爐靜置20分鐘。溶 液完全冷卻后轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中，分別加入5ml濃鹽酸和2g抗壞血酸，靜置Ih使砸單質(zhì) 完全沉淀，過(guò)濾并收集沉淀，然后用Iml皿r-Br2溶解，加蒸饋水至20-25ml，再加幾滴5%苯 酪溶液去除溶液里剩余的化2,用DAB法測(cè)定砸的含量。
[0029] 細(xì)胞破碎和光照強(qiáng)度的設(shè)定：本發(fā)明采用蛋白核小球藻的細(xì)胞破碎采用"纖維素 酶+超聲法"；分別將破碎細(xì)胞和完整細(xì)胞接種在砸濃度為150mg/L的BG-Il培養(yǎng)基中， 控制培養(yǎng)基的抑為7,蛋白核小球藻液濃度Aess為0. 90,培養(yǎng)溫度為25°C;光照強(qiáng)度為 0-72(K)Lx，每組間梯度為1440LX，共分為6組；
[0030] 培養(yǎng)時(shí)每日手搖=次，記錄溶液變紅所經(jīng)歷時(shí)間W及單質(zhì)砸含量。砸轉(zhuǎn)化率按如 下公式計(jì)算：砸轉(zhuǎn)化率=單質(zhì)砸含量/總砸含量X100%。
[0031] 小球藻或稱蛋白核小球藻的生長(zhǎng)狀態(tài)的劃分：分別取處于不同生長(zhǎng)期的蛋白核小 球藻，遲緩期、遲緩-對(duì)數(shù)期、對(duì)數(shù)期、對(duì)數(shù)期-穩(wěn)定期和穩(wěn)定期，接種在砸濃度為150mg/L 的BG-Il培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基抑為7,在光照