源重組辦法，敲除M2014574 基因組的poxB基因（1278bp)，獲得的重組菌為M2014574ApoxB。
[0024] 將M2014574與M2014574Apta分別接種于250ml的S角瓶中37°C厭氧與好氧培 養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基添加40g/L甘油。好氧培養(yǎng)時(shí)S角瓶用8層紗布封口；厭 氧培養(yǎng)條件時(shí)接種前瓶里的空氣用氮?dú)庵脫Q后=角瓶用橡皮塞密閉封口。 陽(yáng)O巧]培養(yǎng)12小時(shí)后，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體濃度、1，3 -PDW及乙酸的濃度，結(jié)果如表1 所示。從表1中可W看出，敲除poxB后顯著降低了菌體的生長(zhǎng)，也導(dǎo)致1，3 -PD產(chǎn)量的下 降。而且單獨(dú)敲除poxB基因厭氧培養(yǎng)時(shí)單位菌體乙酸合成的速度也沒(méi)有降低，相反在好氧 培養(yǎng)時(shí)乙酸合成的速度缺大大增加了。
[0026] 表1 :敲除poxB菌株厭氧與好氧搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果
[0027]
[0028] 實(shí)施例2、單獨(dú)敲除Pta基因?qū)w生長(zhǎng)和1，3 -PD的合成幾乎沒(méi)有影響
[0029] 將12014574菌株于18培養(yǎng)基（0.5%酵母提取物，1%膜蛋白腺，1%化(：1，9肪0) 中37°C培養(yǎng)過(guò)夜，抽提基因組。W抽提好的M2014574基因組為模板，依據(jù)NCBI登錄的克雷 伯氏肺炎桿菌MGH78578的基因組序列ODCUS:NC_ 009648)上的Pta基因（locus_tag: KPN_02688)設(shè)計(jì)引物，PCR反應(yīng)結(jié)束后膠回收目的條帶并測(cè)序，測(cè)序后對(duì)目的條帶進(jìn)行基 因分析，與MGH78578上poxB基因的相似度為100%。用同源重組辦法，敲除M2014574基因 組的poxB基因（2133bp)，獲得的重組菌為M2014574Apta。
[0030] 將M2014574與M2014574Apta分別接種于250ml的S角瓶中37°C厭氧與好氧培 養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基添加40g/L甘油。好氧培養(yǎng)時(shí)S角瓶用8層紗布封口；厭 氧培養(yǎng)條件時(shí)接種前瓶里的空氣用氮?dú)庵脫Q后=角瓶用橡皮塞密閉封口。
[0031] 培養(yǎng)12小時(shí)后，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體濃度、1，3 -PDW及乙酸的濃度，結(jié)果如表2 所示。從表2中可W看出，敲除Pta后菌體生長(zhǎng)和1，3 -PD的合成幾乎沒(méi)有影響。
[0032] 表2 :敲除Pta菌株厭氧與好氧搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果
[0033]
[0034] 實(shí)施例3、同時(shí)敲除poxB和pta基因?qū)w沒(méi)有很大的抑制，但是1，3 -PD的合 成提高了
[0035] 按實(shí)例1和2的方法同時(shí)敲除克雷伯氏肺炎桿菌M2014574,獲得的重組菌為 M2014574 A poxB - pta〇
[0036] 將M2014574 與M2014574ApoxB_pta分別接種于 250ml的S角瓶中 37°C厭氧 與好氧培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基添加40g/L甘油。好氧培養(yǎng)時(shí)S角瓶用8層紗布 封口；厭氧培養(yǎng)條件時(shí)接種前瓶里的空氣用氮?dú)庵脫Q后=角瓶用橡皮塞密閉封口。
[0037] 培養(yǎng)12小時(shí)后，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體濃度、1，3 -PDW及乙酸的濃度，結(jié)果如表3 所示。從表2中可W看出，同時(shí)敲除poxB和pta基因后，M2014574ApoxB-pta的菌體生 長(zhǎng)并沒(méi)有和單獨(dú)敲除poxB基因的一樣生長(zhǎng)受抑制，其菌體生長(zhǎng)幾乎和出發(fā)菌株M2014574 一樣。比較發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下M2014574ApoxB-Pta的1，3 -PD合成提高了，而且乙酸 的合成也減少了。
[0038] 雖然有關(guān)poxB和Pta是乙酸合成的相關(guān)基因在大腸桿菌中有報(bào)道，但是一般研 究表明Pta參與的途徑是乙酸合成的關(guān)鍵途徑，poxB-般被認(rèn)為是一條可有可無(wú)的補(bǔ)充途 徑。本發(fā)明的研究表明：1)在克雷伯氏肺炎桿菌中poxB能起到更關(guān)鍵的作用，敲除poxB后 菌體的生長(zhǎng)顯著的受到抑制，但是單獨(dú)敲除poxB并不能降低乙酸的合成；2)同時(shí)敲除poxB 和Pta和菌體的生長(zhǎng)特性得到恢復(fù)，并且厭氧條件下乙酸的合成降低，而且1，3 -PD的產(chǎn) 量提高。上述結(jié)果都是本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新之處。
[0039] 表3 :同時(shí)敲除poxB和Pta菌株厭氧與好氧搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果
[0040]
[0041] 實(shí)施例4、同時(shí)敲除poxB和pta基因?qū)υ诨磻?yīng)器上1，3 -PD的生產(chǎn)水平大大 提高了
[0042] 化反應(yīng)器發(fā)酵實(shí)驗(yàn)如下：將菌株（M2014574ApoxB-pta、M2014574)接入250ml 的搖瓶（裝液量50ml)進(jìn)行種子培養(yǎng)20小時(shí)，后接入化發(fā)酵罐中（發(fā)酵液裝液量化)，按 照如下所示的工藝條件控制發(fā)酵過(guò)程。
[0043] 初始甘油濃度60g/l，發(fā)酵溫度35°C;通氣量1.Ovvm;攬拌轉(zhuǎn)速20巧m;在發(fā)酵過(guò) 程中通過(guò)加入化OH溶液控制抑值為5. 5~7. 5。在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)期通過(guò)補(bǔ)入不同濃度甘 油溶液控制甘油濃度在10~60g/l，發(fā)酵30小時(shí)結(jié)束。 W44] 發(fā)酵結(jié)果表4所示。從表4中可W看出，在化反應(yīng)器上，同出發(fā)菌株M2014574相 tt，同時(shí)敲除poxB和Pta基因的菌株M2014574ApoxB-ptal，3 -PD的產(chǎn)量和和轉(zhuǎn)化率 大幅度提高，且副產(chǎn)物乙酸的合成顯著降低。
[0045] 表4 :兩菌株發(fā)酵結(jié)果
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種更更高效轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)I，3-丙二醇的方法，其特征在于，將克雷伯氏菌中的兩 個(gè)基因poxB和pta同時(shí)敲除，高效生產(chǎn)1，3-丙二醇。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的poxB和pta基因具體為：poxB基 因負(fù)責(zé)編碼丙酮酸氧化酶（EC 1. 2. 5. 1)，該酶又稱(chēng)丙酮酸脫氫酶；pta基因負(fù)責(zé)編碼磷酸 轉(zhuǎn)乙酰酶（EC 2. 3. 1.8)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-丙二醇的菌 株為克雷伯氏肺炎桿菌（K lebsiella pneum on iae) 〇
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種將克雷伯氏肺炎桿菌K？lebsiella？pneum？on？iae中的兩個(gè)基因poxB和pta同時(shí)敲除，更高效轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3－丙二醇的方法。本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)是：這兩個(gè)基因敲除后減少了副產(chǎn)物乙酸的合成，大幅度提高了克雷伯氏肺炎桿菌(K？lebsiella？pneum？on？iae)轉(zhuǎn)化甘油生成1，3－丙二醇的生產(chǎn)效率。
【IPC分類(lèi)】C12R1/22, C12N15/74, C12P7/18
【公開(kāi)號(hào)】CN105154476
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510621014
【發(fā)明人】宮衡, 林杰, 傅水林
【申請(qǐng)人】華東理工大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月25日